研究背景二硫化碳(Carbondisulfide,CS2)是一种具有挥发性的化学性有机溶剂和原材料,在工业上用途广泛,接触CS2作业的工人数量庞大。因此,CS2所致的职业危害一直是人们关注的重点。近几年来,CS2对女性职业人群生殖健康的损害引起人们的关注。大量流行病学研究表明,暴露于CS2的女性职业人群的自然流产、早早孕丢失和出生缺陷发生率明显高于对照组。在以前的研究中发现,暴露于CS2的孕鼠其胚胎植入数量明显降低。胚胎植入障碍是CS2致女性生殖损伤的重要毒性表现形式之一,但关于其毒作用机制我们尚不清楚。胚胎植入是一个复杂的生理过程,是妊娠建立的标志和首要环节。蜕膜化过程和血管生成过程对成功的胚胎植入提供至关重要的作用。树突状细胞(dendritic cells,DCs),专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)与胚胎植入过程息息相关,一方面作为一种典型的免疫细胞,针对半抗原的胎儿调节母胎界面的免疫耐受,另一方面调节子宫的蜕膜化和血管生成过程。近几年来,大量的证据表明在小鼠早期妊娠期间,DCs非免疫方向的调节功能已经超越了它作为免疫细胞方向的功能,特别是最近的研究强调了 DCs参与调节蜕膜化和血管生成过程。研究发现,去除植入窗口期孕鼠子宫内的DCs后,蜕膜化过程严重损害并且胚胎植入失败,发现植入失败跟损害的蜕膜化过程有关。去除植入期小鼠体内的DCs后,植入位置的血管平滑肌细胞标志物密度减少,说明血管生成受到损害;同时用动态磁共振成像对小鼠蜕膜血管进行功能分析,发现去除体内DCs后蜕膜血管中的血液体积减少、毛细血管渗漏物增多。以上结果说明,去除DCs不仅降低血管通透性,而且还损害血管生成和血管成熟。另外,子宫中的DCs能够产生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体VEGFR,直接参与子宫血管生成过程。研究目的本研究以胚胎植入窗口期暴露于CS2,建立CS2致小鼠胚胎植入障碍的模型,观察子宫中DCs数量的变化,分析DCs与胚胎植入之间的关系,探究机体暴露于CS2后是否通过改变DCs的数量而致胚胎植入障碍;观察子宫蜕膜化标志因子白细胞介素-11(Interleukin-11,IL-11)和血管生成相关因子VEGF和其配体Flt-1(VEGF1)的表达水平,阐明机体暴露于CS2后,是否通过改变DCs的数量进一步干扰蜕膜化过程和血管生成过程,从而致胚胎植入障碍。研究方法1.动物分组和暴露设计7-9周清洁级性成熟昆明种小鼠,雌性体重约30-35g,雄性体重约35-40g。小鼠自由饮食,自然采光。按雌雄2:1合笼,次日检查阴栓,阴栓阳性者记为孕第1天(the first day in gestation,GDI)。设计GD4和GD5两个暴露时间点,GD4暴露点设置4个观察终点(分别是孕后第5、6、7、9天),GD5暴露点设置3个观察终点(分别是孕后第6、7、9天),染毒组按照631.4mg/kg(0.4LD50)的剂量经腹腔注射CS2,注射体积为0.1ml/10g,对照组注射等体积橄榄油。2.样本采集及实验方法在相应的各观察终点收取小鼠样本,立即收集子宫组织样品于-80℃冷冻保存,用于实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测。收集新鲜的子宫内膜用于流式细胞术。小鼠摘眼球取血后,离心,收集上清液并储存在-80℃低温冰箱中,血清样品用于ELISA检测。3.统计学分析方法所有实验结果数据用统计学软件(SPSS 19.0)进行分析。对于两组实验数据进行比较时,若数据符合正态分布且方差齐,采用两组独立样本的t检验;若不符合正态分布的数据则采用两组独立样本的t’检验。对于多组实验数据,若方差齐,单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进行F检验,同时选择Dunnett-t test进行实验组与对照组指标均数比较;若方差不齐,采用非参数统计方法(Kruskal-WallisH法)。数据以均值±标准差表示。以P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.CS2对胚胎及母体的影响胚胎毒性:胚胎植入数目观察结果显示,与对照组相比,GD4和GD5染毒后其胚胎植入数目分别下降了 20.6%和22.4%,差异具有统计学意义(P<0.05),说明在植入窗口期暴露于CS2后导致小鼠胚胎植入障碍。胚胎发育结果显示,染毒组的宫胚窝重、胚胎窝重、平均宫胚窝重和平均胚胎窝重与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),说明在植入窗口期暴露于CS2后对胚胎发育无显著影响。母体毒性:母体体重观察结果显示,染毒期间孕鼠体重和体重增重与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。母体器官系数观察结果显示,染毒后孕鼠心、肺、肾、卵巢、子宫等脏器系数与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。说明胚胎植入期暴露于CS2对孕鼠母体无显著影响。2.CS2对子宫内膜树突状细胞数量的影响GD4染毒后,GD5观察终点子宫内膜DCs数量与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),子宫内膜DCs数量降低21%。GD6和GD7观察终点子宫内膜中DCs的数量与对照组相比均降低,差异无统计学意义(P>>0.05),说明GD4染毒后对GD5观察终点有显著影响。GD5染毒后,GD6和GD7观察终点子宫中DCs的数量比对照组降低,差异均无统计学意义(P>0.05),说明GD5染毒后对子宫内膜DCs数量无显著影响。3.CS2对子宫蜕膜化过程的标志因子IL-11表达水平的影响GD4染毒后,子宫组织中IL-11mRNA的表达水平,GD5、GD6、GD7观察终点上表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),表达水平分别下降了 89%、88%和60%;子宫组织中IL-11蛋白质表达水平,GD5和GD6观察终点的表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),GD5表达水平上升了 83%,GD6观察终点表达水平下降49%。GD5染毒后,子宫组织中IL-11mRNA的表达水平,GD6、GD7观察终点上表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01),表达水平分别下降78%和90%;子宫组织中IL-11蛋白质表达水平,GD6观察终点表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),表达水平下降72%。4.CS2对子宫组织血管生成因子VEGF和其配体Flt-1表达水平的影响子宫组织中VEGF表达的影响:①GD4染毒后,子宫组织中VEGFmRNA的表达水平,GD6、GD7观察终点表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),表达水平分别下降79%和71%;子宫组织中VEGF蛋白质的表达水平,GD6观察终点表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),表达水平下降30%。②GD5染毒后,子宫组织中VEGFmRNA的表达水平,GD7观察终点表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),表达水平下降了 62%;子宫组织中VEGF蛋白质的表达水平,GD7观察终点表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),表达水平下降36%。子宫Flt-1表达的影响:①GD4染毒后,子宫中Flt-1mRNA的表达水平,GD5、GD6、GD7观察终点的表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),表达水平分别下降58%、54%和60%;子宫中Flt-1蛋白质的表达水平,GD6、GD7观察终点的表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),表达水平分别下降36%和46%。②GD5染毒后,子宫中Flt-1mRNA的表达水平,GD7观察终点的表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),表达水平下降60%;子宫中Flt-1蛋白质的表达水平,GD6、GD7观察终点子宫组织的表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),表达水平分别下降40%和 44%。5.CS2对外周血中血管生成因子VEGF表达水平的影响GD4染毒后,外周血中VEGF蛋白质的表达水平,GD7观察终点表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),表达水平上升73%。GD5染毒后,外周血中VEGF蛋白质的表达水平,GD7观察终点的表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),表达水平上升57%。结论1.子宫蜕膜化过程和血管生成过程的损害可能是CS2致小鼠胚胎植入障碍的重要机制之一;2.树突状细胞可能参与了 CS2致胚胎植入障碍的过程。小鼠暴露于CS2后,可能通过减少子宫内膜DCs的数量,进而影响DCs对蜕膜化过程和血管生成过程的调节,而导致胚胎植入失败,但这种调节作用可能是有限的;3.小鼠暴露于CS2后,机体对蜕膜化过程和血管生成过程的损伤会出现一个短暂的调节反应;4.外周血中VEGF可作为潜在的胚胎植入障碍生物标志物。