论文部分内容阅读
目的:探究激活mTOR信号通路并联合任务导向性康复训练对小鼠颈5脊髓损伤后轴突再生及上肢功能恢复的影响。方法:1.构建锥体神经元PTEN抑制小鼠模型:采用随机数表法将10只成年野生型小鼠平均分为PTEN组(n=5)和Control组(n=5),分别往运动皮质第Ⅴ层定向注射Lenti-Pten-RNAi和Lenti-scrambled-eGFP两种病毒(病毒滴度均为8E+8 TU/mL)。病毒注射14d后灌注取材,免疫荧光观察两种病毒在运动皮质第Ⅴ层的转染效果、锥体神经元中PTEN的表达量。非参数多重t检验比较两组锥体神经元中PTEN的表达水平差异。2.观察BDA示踪剂对皮质脊髓束示踪效果:采用相同的脑内定向注射方法将BDA示踪剂注射进入小鼠(n=5)运动皮质第Ⅴ层锥体神经元附近,14d后灌注取材。通过对脑皮质冠状切片、延髓锥体交叉冠状切片、颈段脊髓矢状切片BDA显色,免疫荧光观察皮质脊髓束在这三个区域的示踪效果。3.采用随机数表法将40只成年野生型小鼠平均分为PTEN RNAi+Ex组(n=10)、PTEN RNAi组(n=10)和Control+Ex组(n=10)、Control组(n=10),分别往运动皮质第Ⅴ层定向注射Lenti-Pten-RNAi或Lenti-scrambled-eGFP。病毒注射14d后对所有动物采用颈5脊髓钳夹损伤造模。造模损伤4w后,PTEN RNAi+Ex组和Control+Ex组接受长达4w的任务导向性康复训练,PTEN RNAi组和Control组接受阴性训练。伤后8w对所有组进行灌注取材,免疫荧光双标PTEN/p-S6,观察各组锥体神经元内源性再生能力(mTOR)的激活情况;免疫荧光双标BDA/GFAP,观察轴突损伤附近的再生情况;免疫荧光双标BDA/Synapsin I,观察再生轴突的突触重塑情况;免疫荧光双标BDA/NeuN,观察病灶上段灰质前角内轴突出芽及与神经元的结构关系。伤后3d、2w、4w、6w、8w周行水平楼梯和圆筒攀爬探索测试,评估小鼠左侧上肢的运动功能恢复情况。采用非参数多重t检验和单因素方差分析比较各组间相应指标。结果:1.Lenti-Pten-RNAi和Lenti-scrambled-eGFP均被注射到运动皮质第Ⅴ层,扩散感染周围的锥体神经元。此外,PTEN组的PTEN表达水平明显低于Control组(P<0.05)。2.BDA注射14d后,小鼠的运动皮质区清晰可见BDA标记的锥体神经元,延髓锥体交叉、颈段脊髓内均清晰可见BDA标记的皮质脊髓束。3.伤后8w,与Control+Ex组、Control组相比,PTEN RNAi+Ex组和PTEN RNAi组的脑皮质第Ⅴ层p-S6表达水平显著增高(P<0.05)。在脊髓病灶尾侧,PTEN RNAi+Ex组和PTEN RNAi组再生轴突的数量明显多于Control+Ex组和Control组(P<0.05),且PTEN RNAi+Ex组再生距离更远(P<0.05)。其中与PTEN RNAi组相比,PTEN RNAi+Ex组中观察到再生轴突上更多的突触结构(P<0.05)。在病灶上段灰质前角内,PTEN RNAi+Ex组和Control+Ex组具有更多的出芽轴突与神经元共区域。PTEN RNAi+Ex组水平楼梯患侧上肢的错误率在伤后6w、8w的时候低于其他组(P<0.05);圆筒探索试验中患侧上肢的使用频率在伤后8w高于其他组(P<0.05)。结论:1.RNA干扰技术能成功抑制小鼠运动皮质第Ⅴ层锥体神经元PTEN的表达。2.BDA示踪剂能清晰标记和观察CST在脊髓内的形态。3.激活mTOR信号通路联合任务导向性康复训练能进一步促进损伤脊髓轴突再生和突触重塑,并对病灶上方新的神经回路形成和上肢运动功能恢复有一定的积极作用。