[背景和目的]发育性髋关节脱位(Developmental dislocation of the hip, DDH)是小儿矫形外科最常见的疾病之一,骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是其最常见的远期并发症。与正常人相比,DDH骨关节炎发病年龄早且病情重,大多数必须进行全髋关节置换术(Total hip arthroplasty,THA),严重影响了生活质量。本课题组前期研究发现发育性髋关节脱位早期可能已经存在关节软骨的退行性改变。目前对于DDH的早期发生关节软骨退行性变及骨关节炎的分子生物学机制尚不明确,近年来有大量研究表明β-catenin及其所在Wnt信号通路在关节软骨的形成和退行性改变中起关键作用,但β-catenin在髋关节脱位关节软骨的早期退变中有无作用的研究尚未见报道。本研究旨在通过检测β-catenin与关节软骨早期退变有关的胶原、基质金属蛋白酶(MMPs)和解聚素等在DDH早期髋臼软骨中的表达的相关性,探讨β-catenin与DDH早期软骨退行性变化的相关性,研究DDH早期软骨退变的机制,为临床DDH的早期预防骨关节炎提供理论依据,为进一步深入研究DDH与骨性关节炎的关系提供新的思路。[方法]一、DDH动物模型的制作、病理组织学观察1.根据襁褓体位好发髋关节脱位,对新生20只Wistar大鼠双下肢双髋双膝医用胶带并拢模拟襁褓体位固定10天,大体观察证实制模成功情况。2.实验组大鼠固定10天后解除固定继续饲养,对2、4、6、8周DDH模型及对应周期正常发育大鼠各10只髋关节软骨进行大体观察,测量髋臼深度、长度及宽度；股骨头长度及宽度。3.髋关节软骨标本Safranin O/Fast green染色后光镜下观察关节软骨细胞与细胞外基质的病理组织学改变。二、X型胶原、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、ADAMTS-4、ADAMTS-5、β-catenin在不同时期DDH髋关节软骨中的表达1.第一部分DDH模型不同年龄和对应期对照鼠各10只髋关节软骨标本。2.采用免疫组化染色检测X型胶原、MMP-13、β-catenin在不同年龄髋关节软骨中表达的改变。3.采用qRT-PCR法检测X型胶原、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5、β-catenin在不同年龄髋关节软骨中表达的改变,SPSS16.0统计和比较组间差异。三、体外软骨细胞培养,激活β-catenin的表达,检测β-catenin对软骨细胞退行性改变的影响1.8周对照组大鼠髋关节软骨细胞的提取及原代培养,Ⅱ型胶原免疫荧光及甲苯胺蓝染色鉴定,免疫荧光及qRT-PCR检测MMP13及X型胶原的表达,qRT-PCR检测ADAMTS-5的表达,TUNEL法检测软骨细胞凋亡。2.LiCl处理正常发育8周鼠关节软骨细胞,激活β-catenin的表达,qRT-PCR检测X型胶原、MMP-13和ADAMTS-5的表达；检测软骨细胞凋亡情况。3. SPSS16.0统计和比较组间差异。[结果]一、DDH动物模型的制作及病理组织学观察1.建模成功率100%(20只新生大鼠固定10天)。2.髋关节大体观察：实验组关节囊增厚,髋臼浅平,软组织嵌入,股骨头外形扁平,随年龄增长头臼匹配差距增大；测量结果显示2、4周大鼠髋臼及股骨头大小较对照组发育小,但仍呈发育增大趋势,6周后髋臼发育基本停止,髋臼大小开始变小,股骨头发育停止,头臼不对称进一步加重(P<0.01)。3. Safranin0/Fast green染色可见到实验组关节软骨退变征象：Safranin0染色浅层部分染色降低,表明带负电荷蛋白多糖明显降低、4周后关节软骨浅层裂隙形成、浅层中层软骨细胞簇聚及数量减少、关节软骨退变随鼠龄增长而加重。二、X型胶原、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、ADAMTS-4、ADAMTS-5、B-catenin在不同时期DDH髋关节软骨中的表达1.实验组X型胶原、MMP-13在软骨层软骨细胞中不均匀表达,成簇细胞表达明显,胞浆内明显棕色深染细胞数目百分比较对照组多。4周及以后与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),且随鼠龄增长而表达增高。2.实时荧光定量PCR结果显示实验组X型胶原和MMP-13mRNA在4周及以后表达较对照组增加,且随鼠龄增长表达增加；ADAMTS-5在8周时表达增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。ADAMTS-4与实验组比较无统计学差异。3. β-catenin:免疫组织化学中可见β-catenin在对照组大鼠2周时表达较多,随鼠龄增长表达逐渐下降,8周时免疫组化基本无表达；实验组β-catenin表达无下降趋势,持续高表达；实时荧光定量PCR mRNA表达呈相似结果。三、体外软骨细胞培养,检测β-catenin对软骨细胞退行性改变的影响1.软骨细胞培养及鉴定：软骨细胞培养后Ⅱ型胶原免疫荧光及甲苯胺蓝染色鉴定为软骨细胞。2. LiCl激活β-catenin表达：LiCl处理8周正常软骨细胞后免疫荧光及qRT-PCR均提示β-catenin表达明显增高。3.激活β-catenin引起软骨退行性改变：LiCl处理软骨细胞免疫荧光提示X型胶原及MMP-13表达增高明显；qRT-PCR提示X型胶原、MMP-13、ADAMTS-5表达增高(P<0.01);TUNEL染色提示LiCl处理后软骨细胞凋亡明显增加(P<0.01)。[结论]1.DDH动物模型早期关节软骨发育落后并在4周出现发育停滞退变、软骨蛋白多糖丢失等关节软骨退变,这种早期发育异常及软骨退变可能是DDH最终发生骨关节炎的病理学基础。2.与关节软骨退变有关的X型胶原、MMP-13及ADAMTS-5在DDH早期就表达增多,可以作为反映DDH软骨退变的早期敏感生物学指标。3.β-catenin在正常发育早期有促进关节软骨发育的作用,但成熟后不再表达,而在DDH整个发育过程中,关节软骨出现持续高表达提示其可能是参与了软骨退行性变。4.关节软骨发育异常导致β-catenin在DDH动物模型早期持续高表达,并可能引起X型胶原、MMP-13及ADAMTS-5等合成增多,软骨细胞凋亡增加,由此导致关节软骨早期退行性改变,这可能是DDH最终导致骨关节炎发生的机制之一