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H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是一种新出现的人兽共患病原，自从2013年首次在我国报道以来，在人类已引起5波流行，截止2017年10月26日，共有1567人发病，其中包括615例死亡病例，病死率接近40％。早期的H7N9亚型AIV对家禽是低致病性的，家禽感染后无明显症状。2017年初开始出现对家禽呈高致病性的H7N9亚型AIV，分布于全国17个省份，并引发多起疫情。2017年下半年，重组AIV(H5+H7)二价灭活疫苗使用后，有效控制了家禽中的H7N9疫情，也显著减少了人的感染病例。但目前仍可在我国个别省份分离到对鸡和鸭均呈高致病性的H7N9和H7N2亚型AIV，使我国H7亚型AIV的防控面临新的挑战。因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物的标记疫苗以及快速检测方法用于H7亚型AIV的防控和净化。 1.鉴别九种禽流感病毒神经氨酸酶基因的一步法多重探针组合rRT-PCR方法的建立 目前，已经在家禽和野鸟中鉴定出了9种不同的禽流感病毒神经氨酸酶(NA)亚型，由于AIV很容易发生重组，同一种血凝素(HA)亚型的AIV可能存在不同的NA组合，在鉴定HA的同时也需要鉴定出NA亚型。我们设计了9个亚型的NA引物-探针对，根据探针的不同荧光染料（FAM，HEX和Texas Red）将其分成3组，开发了一种基于多重探针组合的一步法rRT-PCR。结果显示，该多重rRT-PCR方法中的每组引物-探针对检测相应的不同亚型的NA特异性良好，无交叉反应;其检测限均小于100 copies和100 EID50。利用该方法分别检测人工感染H9N2病毒鸡的排毒样品和活禽交易市场的临床样品，结果显示，该方法检测结果的阳性率与病毒分离和基因测序方法的结果相一致，且灵敏度更高。综上所述，我们建立的这种快速、特异且灵敏的多重探针组合rRT-PCR方法，为NA分型提供了新的快速检测方法。 2.快速检测H7亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条的研制 以H7N9亚型AIV（A/Chicken/Jiangsu/W1-8/2015，W1-8）作为免疫原制备单克隆抗体，利用抗原逃逸试验和HA基因序列测定及分析确定其针对的抗原表位，选择具有不同抗原表位的单抗研制检测H7亚型AIV的免疫胶体金试纸条。结果显示，共获得了13株具有血凝抑制特性的单抗，鉴定出198、227和235位3个抗原表位。选取了针对227位和235位的单抗制备免疫胶体金试纸条，结果表明，该试纸条具有良好的特异性、稳定性。棉拭和组织样品的检测限均为2.5 log10 EID50/0.1mL。活禽市场样品的病毒检出率为3％(6/200)，与病毒分离结果(4.5％，9/200)和HA基因PCR测序结果(3.5％，7/200)一致。这为现场快速检测H7亚型AIV提供了新方法。 3.H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制 通过多肽芯片的检测方法成功筛选到针对H7N9亚型AIV HA2上的特异性抗原表位H7-12肽，利用反向遗传技术修饰该抗原表位，并以H7N9毒株A/Chicken/Huadong/JD/17(JD/17)为骨架，研制出H7N9亚型AIV灭活标记疫苗候选株A/Chicken/H uadong/JD-cHA/17(JD-cHA/17)。该疫苗候选株的HA效价为10 Log2，EID50为9.67 Log10EID50/mL;在一次免疫鸡群3周后，HI抗体效价能达到9.2±0.6，表明该疫苗候选株具有良好的抗原性和免疫原性。攻毒保护试验结果表明，该疫苗候选株的免疫保护效果与母本毒株相当，对高致病性(HP)和低致病性(LP)H7N9 AIVs均有100％的保护率。利用H7-12多肽芯片技术成功检测出自然感染后第3d血清转阳情况[信噪比(SNR)=2.33±0.15]，灵敏度高于HI试验(HI=0)。疫苗候选株DIVA特性验证结果显示，利用H7-12多肽芯片检测疫苗候选株JD-cHA/17免疫血清（HI=9.2±0.6）和野生型毒株JD/17免疫血清（HI=9.1±0.5），其针对H7-12多肽的SNR值分别为0.44±0.14和6.39±0.13，差异极显著，表明该灭活标记疫苗不能诱导针对H7特异性的H7-12多肽的抗体，具有DIVA特性和广泛的应用前景。 4.区分H7N9亚型禽流感标记疫苗免疫血清和野毒株感染血清的竞争抑制ELISA方法的建立 利用H7特异性表位H7-12多肽与BSA偶联作为免疫原，成功制备了6株单克隆抗体。IFA和Western-blot试验结果显示，该6株单抗均能与H7N9亚型AIVJD/17反应，特异性良好。以JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清为测试血清样品，利用竞争抑制ELISA方法，成功筛选出具有高抑制率的单抗3G10。将H7-12多肽作为包被抗原，纯化的3G10单抗腹水以辣根过氧化酶(HRP)进行标记作为检测抗体，建立针对H7-12抗体的竞争抑制ELISA方法。对竞争抑制ELISA方法的反应条件进行优化，确定抗原的最适包被浓度为50μg/mL，酶标抗体的最适工作浓度为1∶200，待检血清最适稀释度为1∶4，封闭液的最佳选择为8％的小牛血清封闭90 min，TMB的最佳反应时间为10 min。判断标准为抑制率≥20％为阳性，≤16％为阴性。运用本方法检测JD/17自然感染血清为阳性，检测JD-cHA/17免疫血清，H1、H3、H4、H5(RE-6、RE-7和RE-8)、H6、H9和H10亚型AIV的阳性血清均为阴性，说明该竞争抑制ELISA方法具有良好的特异性，可有效区分JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清。