ssDNA的固定化及其与蛋白质相互作用的研究

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lilac_cs
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蛋白质组学作为后基因组时代最重要的研究领域之一越来越受到人们的关注。而对于低丰度蛋白质的研究则是目前蛋白质组学研究的瓶颈问题之一。一种基于多肽库结构多样性的新技术通过对高、低丰度蛋白质的等量吸附实现了对不同丰度蛋白质的均衡,有利于低丰度蛋白的研究。同时,寡核苷酸库也被证实具有相应的结构多态性。因此,我们希望基于寡核苷酸的多态性建立一种用于均衡高低丰度蛋白质的技术。为实现这一目标,本论文对包括表面修饰对交联琼脂糖凝胶性状的影响、ssDNA的最佳固定化方式和ssDNA与蛋白质作用的影响因素等与此目标相关的基础问题进行了研究。实验结果表明:(1)琼脂糖表面70%的羟基可被CDI活化,最大活化密度可达4.4mmol/g dry gel,且在一定范围内活化密度与活化剂的加入量成正比。连接了不同分子的凝胶因为氮元素或芳环的引入导致凝胶内部以及凝胶与水分子所形成氢键的强度的变化,使其耐压能力有所提高,平均粒径增大,孔径普遍缩小,固形物的含量有所增加。且上述变化与修饰密度相关,较高的修饰密度下凝胶的各项参数都会发生较大改变。(2)通过多糖载体实现的ssDNA直接固定化不能保证ssDNA形成有效的构象,不适于本研究;高密度固定会导致ssDNA链之间形成氢键,不利于ssDNA形成特定的空间构象;而以琼脂糖凝胶为载体,采用亲和素-生物素系统低密度间接固定ssDNA的材料,降低了ssDNA与载体表面基团、ssDNA链与链之间的氢键作用,ssDNA可以形成其特定的空间构象,最终实现对蛋白的吸附。(3)对于ssDNA,能够促进其特定空间结构的变性-复性方式、缓冲液体系都能够影响其与蛋白质的相互作用:80℃加热变性-室温缓慢冷却复性、含一定盐离子的结合缓冲液更利于ssDNA与蛋白质相互作用;实验温度条件对ssDNA与蛋白质之间相互作用的影响不大。(4)以对溶菌酶适配体和IgG适配体的研究为例的研究证实利用ssDNA可以实现对低浓度蛋白有选择性的富集以及高、低丰度蛋白质的均衡,这一结果为进一步实现利用寡核苷酸库结构的多样性均衡不同丰度蛋白质提供了参考。
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