研究背景胰腺癌是病死率度最高的恶性肿瘤之一,其术后五年总体生存率低于7%。这种不良预后主要是由于胰腺癌早期诊断困难、早期侵袭转移和高耐药性。手术切除是唯一有效的治疗方法,然而大部分患者就诊时已处于局部晚期或有远处转移,仅有10%~15%的患者有手术切除治疗机会,其余患者只能接受放化疗。吉西他滨(Gemcitabine)是中晚期胰腺癌的一线化疗药物,可以有效缓解症状和改善预后,但由于胰腺癌患者对吉西他滨药物的高度耐药性,其治疗效果有限。因此迫切需要研发新的胰腺癌诊断方法和治疗策略。微小RNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA,在转录后调控中起重要作用。miRNA主要通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)结合,降解mRNA或抑制其翻译,发挥生物学功能。研究发现,几乎所有类型的肿瘤中都存在miRNA表达的改变。miRNA作为抑癌基因或致癌基因,通过多种途径调节肿瘤细胞的功能,如增殖、侵袭转移和对治疗的抗性,影响肿瘤的发生和进展。已有报道发现,当前一系列miRNA(包括miR-21,miR-34a,miR-30d,miR-155和miR-203)与胰腺癌患者的进展和总生存率相关。我们课题组前期的研究表明miR-15a通过下调Bmi-1的表达,抑制胰腺癌细胞增殖和上皮间质转化。这些研究表明miRNA参与了胰腺癌的发生发展。miR-506是灵长类动物中X染色体连锁的miRNA簇的成员之一。最近研究发现miR-506在多种肿瘤中起重要作用。然而在不同类型的肿瘤中,miR-506的作用不尽相同,甚至是相反的。例如,miR-506在卵巢癌和肺癌中起抑癌基因作用,但在黑素瘤中起着促癌基因的作用,表明miR-506可以以组织类型依赖的方式起作用。然而,miR-506是否以及如何参与胰腺癌的发病机制尚有待研究。我们接下来将探讨miR-506在胰腺癌中的表达、功能及作用机制,为临床诊治提供可能的潜在靶点。越来越多的研究表明SPHK1与肿瘤的发生发展密切相关,例如参与肿瘤细胞的癌变、增殖、转移以及肿瘤微环境中新生血管的形成。研究显示SPHK1在多种肿瘤中高表达,包括胃癌、神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌和非霍奇金淋巴瘤等,并且其表达与肿瘤的进展和患者的预后相关。这些研究结果提示SPHK1是潜在的肿瘤治疗靶点。研究表明用siRNA或药物抑制SPHK1可以显著抑制上皮性卵巢癌的增殖、迁移和血管生成。SPHK1特异性抑制剂SK1-I通过调节Cer-Sph-S1P的平衡,抑制胆管癌细胞增殖并诱导凋亡。另一项研究显示SPHK1在人结直肠癌中过表达和过度活化,并且SPHK1可以促进结直肠癌对化疗药物西妥昔单抗的抵抗。虽然miR-506和SPHK1都参与肿瘤的进展,但是它们影响癌症发展,特别是作用于胰腺癌的分子机制仍不清楚。研究目的研究miR-506在胰腺癌中的临床意义,以及其在胰腺癌进展中的作用机制。研究方法采用q RT-PCR检测胰腺癌中miR-506的表达,统计软件SPSS分析miR-506表达与胰腺癌患者临床病理特征的相关性。通过体内外实验(CCK-8细胞增殖/毒性实验、流式检测细胞周期/凋亡)研究了miR-506对人胰腺癌细胞系As PC-1和PANC-1细胞增殖、细胞周期、凋亡和化学敏感性的影响。应用生物信息学预测和信号网络分析鉴定miR-506的作用靶点,进一步通过荧光素酶报告基因,rescue实验以及免疫组织化学(IHC)和蛋白印迹检测下游效应因子。采用q RT-PCR和IHC研究miR-506与下游信号因子在胰腺癌中的临床相关性。通过焦磷酸测序检测miR-506启动子DNA甲基化情况。研究结果1.胰腺癌中miR-506的表达及临床意义。(1)胰腺癌组织、癌旁组织及正常组织中miR-506的表达情况。我们用q RT-PCR检测了13对胰腺癌及相应癌旁组织,以及10例正常胰腺组织中miR-506的表达情况,结果显示:在胰腺癌组织中,miR-506的表达水平显著低于其相对应的癌旁组织(P<0.001)。进一步我们扩大样本(84例)检测胰腺癌组织中miR-506的表达情况,结果显示与正常胰腺组织相比,miR-506在胰腺癌组织中显著低表达(P<0.001)。(2)胰腺癌组织中miR-506表达与临床病理参数相关性分析。收集并统计84例胰腺癌患者的临床病理参数,分析miR-506表达与临床的相关性,发现miR-506的表达与临床分期、T分期、远处转移有关(分别P<0.001,P=0.002,P=0.004),接下来我们分析miR-506表达与患者生存时间的关系。结果显示miR-506高表达组生存时间明显长于miR-506低表达组,Log-rank检验两组生存曲线有显著性差异(P<0.001)。进一步对84例胰腺癌患者的临床资料建立Cox比例风险回归模型,多变量分析miR-506表达、临床分期和T分期是影响患者预后的独立危险因素[hazard ratio(HR),1.880;95%CI,1.048 to 3.026;P=0.033]。2.miR-506在体内外抑制胰腺癌细胞增殖和阻滞细胞周期。(1)q RT-PCR检测miR-506在胰腺癌细胞系中的表达情况,结果发现:以正常细胞系HPC-Y5为对照,在5种胰腺癌细胞系miR-506的表达均低于在正常细胞系HPC-Y5中的表达,并且在As PC-1胰腺癌细胞系中表达最低;在Bx PC-3细胞中miR-506表达最高。(2)miR-506对于胰腺癌体外生物学特性的影响。1)采用CCK-8法检测转染miR-506慢病毒及其Vector后As PC-1和PANC-1胰腺癌细胞的增殖能力,结果显示miR-506组细胞的增殖能力明显较Vector组受到抑制(P<0.05)。结果提示:过表达miR-506能抑制胰腺癌细胞的体外增殖能力。2)将转染miR-506慢病毒及对应Vector组As PC-1和PANC-1胰腺癌细胞进行流式细胞术检测细胞周期。结果显示与对照组相比,miR-506过表达组As PC-1和PANC-1的G0/G1期细胞比例显著增高,而S期细胞比例降低。(3)miR-506抑制人胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤能力。采用裸鼠皮下成瘤实验进一步检测miR-506对As PC-1胰腺癌细胞体内增殖能力的影响。裸鼠成瘤的统计结果显示,miR-506过表达组较对照细胞组的移植肿瘤的生长速度慢,体积也显著小于对照组;30天后处死裸鼠,解剖取出肿瘤,测量重量,结果显示miR-506慢病毒组肿瘤明显小于对照组,两组差异有统计学意义。裸鼠皮下肿瘤免疫组化Ki-67的检测,结果显示miR-506慢病毒过表达组Ki-67的表达较对照组显著降低。3.miR-506促进胰腺癌细胞凋亡和增强化疗敏感性。(1)转染miR-506mimic后进行流式细胞凋亡检测,发现As PC-1和PANC-1过表达miR-506后,与对照组细胞相比,凋亡细胞比例明显增加,存在显著统计学差异。(2)CCK-8细胞毒性试验检测结果表明,与对照组相比,不同浓度的吉西他滨处理后miR-506转染组AsPC-1、PANC-1细胞存活率明显降低,统计结果差异有统计学意义。提示miR-506可增强胰腺癌细胞对吉西他滨化疗的敏感性。(3)Western blot检测吉西他滨处理后miR-506组和对照组细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP表达。结果显示,miR-506组细胞cleaved caspase-3和cleaved PARP表达增加。4.胰腺癌中miR-506靶向SPHK1。(1)生物信息学技术(TargetScan和miRanda)预测,发现miR-506与SPHK1mRNA中的保守序列相匹配,提示miR-506可能调控SPHK1。(2)Western blot检测miR-506 mimic、miR-506 inhibitor及其对应NC转染细胞后SPHK1蛋白的表达。结果显示:与mimic-NC相比,miR-506 mimic转染组胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1中SPHK1蛋白的表达明显减少(P<0.05)。与inhibitor-NC相比,miR-506inhibitor转染组PANC-1和BxPC-3细胞中SPHK1蛋白的表达明显升高(P<0.05)。说明SPHK1极有可能是miR-506的靶基因。(3)双荧光素酶报告实验显示,miR-506可以显著降低野生型报告基因的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型报告基因的荧光素酶的活性无明显影响。(4)通过q RT-PCR和Western blot检测胰腺癌细胞系和组织中miR-506和SPHK1的表达情况,SPSS软件Spearman相关性分析,发现二者在胰腺癌细胞系和组织中呈显著负相关(均P<0.05)。5.胰腺癌中SPHK1的表达及其与临床病理参数相关性研究。(1)免疫组化检测正常胰腺组织SPHK1蛋白少量表达或者不表达,而在胰腺癌组织中明显高表达。(2)统计分析SPHK1与临床病理参数的相关性。结果显示SPHK1表达与临床分期、T分期、淋巴结转移及远处转移相关;Kaplan-Meier生存分析发现,与SPHK1低表达患者相比,SPHK1高表达患者生存时间短(Log rank:P<0.001);并且在早期(stages I and II)和晚期(stages III and IV)胰腺癌患者亚组中均得到一致的结论;同时,采用Cox回归多因素模型分析,发现SPHK1表达是胰腺癌患者预后独立的危险因素(HR,1.395;95%CI,1.107 to 1.758;P=0.005)。6.干扰SPHK1抑制胰腺癌细胞增殖、阻滞细胞周期、促进凋亡和增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性,与过表达miR-506对胰腺癌细胞的影响一致。7.miR-506介导的SPHK1表达下调抑制Akt/NF-κB信号通路。(1)Western blot结果显示miR-506过表达抑制Akt/NF-κB信号通路,p-Akt、p-IκBα、NF-κB(p65)和Bcl-2表达较对照组明显下调,NF-?B报告基因实验结果显示SPHK1上调可以解除miR-506介导的NF-κB活性转录抑制;而SPHK1过表达慢病毒载体的反转阻断了miR-506介导的Akt/NF-κB通路失活。(2)SPHK1反转解除miR-506对胰腺癌细胞增殖、细胞周期和化疗敏感性的影响。(3)胰腺癌临床样本中miR-506与SPHK1/Akt/NF-κB通路活化负相关。8.启动子DNA甲基化介导miR-506在胰腺癌中低表达。(1)首先我们在miR-506基因的启动子富含CpG区域中鉴定了5个CpG位点。(2)焦磷酸测序分析检测13对胰腺癌与癌旁miR-506基因启动子DNA甲基化情况,结果显示,在miR-506启动子的5个甲基化位点中,与相应的癌旁组织相比,位点5在胰腺癌组织中呈现明显高甲基化的趋势,有显著统计学差异,而在其余4个位点在癌与癌旁组织间甲基化水平无显著差异。(3)胰腺癌中miR-506启动子DNA甲基化水平与miR-506表达呈负相关。(4)去甲基化试剂5-aza-CdR提高了胰腺癌细胞株miR-506基因mRNA的表达。(5)胰腺癌组织中miR-506甲基化水平与患者预后的关系分析发现:miR-506低甲基化组生存时间明显长于miR-506高甲基化组,Log-rank检验两组生存曲线有显著性差异(P=0.002)。结论1.miR-506在胰腺癌组织和细胞中低表达,并且miR-506低表达患者预后差。2.体内外功能实验表明,miR-506抑制细胞增殖和皮下成瘤、阻滞细胞周期、促进胰腺癌细胞凋亡和增强化疗敏感性,在胰腺癌中起抑癌基因作用。3.miR-506通过负性调控其靶基因SPHK1表达,抑制AKT/NF-κB信号通路的活化;并且在胰腺癌临床样本中,miR-506与SPHK1/AKT/NF-κB信号通路的活化密切相关。4.启动子DNA甲基化介导miR-506在胰腺癌中低表达。5.miR-506/SPHK1轴可能是胰腺癌发生和进展的重要机制之一,并为基于miR-506的胰腺癌防治提供新的靶点和标志物。