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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, H. parasuis)属于革兰氏阴性菌,是猪革拉瑟氏病(Glasser’s disease)的病原体。其主要导致猪纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。然而,该病的致病机制仍不清楚。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin, CDT)是20世纪80年代末期发现的细菌毒素之一,该毒素由CdtA、CdtB和CdtC3个亚基组成,引起真核细胞DNA双链断裂,导致细胞周期的不可逆性阻滞或者靶细胞凋亡。H. parasuis SH0165株基因组含有编码CDT的cdtABC基因簇,具有同其它菌CDT相似的功能,但还没有其体内功能的研究。鉴于该毒素的特殊功能,而H. parasuis危害严重且没有毒力因子得到直接的鉴定。因此,很有必要对该基因对动物的致病性进行研究。本研究以H. parasuis SH0165菌株cdtABC基因簇为研究对象,体外重构CDT,通过细胞毒性试验、模型动物和本动物试验及构建cdt基因缺失突变株分析该毒素在H. parasuis感染与致病中的作用。主要研究内容如下：1.CDT的原核表达及活性检测：根据NCBI公布的H. parasuis SH0165株全基因组序列,设计特异性引物扩增cdt基因,克隆到原核表达载体pET28a,并转化E. coli BL21(DE3),成功表达CDT。将CDT与猪髋动脉内皮细胞(PIEC)共孵育后,导致细胞膨胀甚至死亡。体外研究结果表明原核表达CDT具有生物活性。2.CDT致豚鼠组织损伤：为了研究CDT在体内的功能,我们将该毒素按5mg的剂量腹腔注射豚鼠,并在注射后1d、2d、3d、4d和5d剖杀豚鼠,观察病理变化,同时取病变明显的肝脏和脾脏制备组织切片。结果显示在注射后3d剖杀豚鼠,肝脏和脾脏肉眼可见纤维素性渗出。组织切片结果显示注射后3d肝脏和脾脏细胞膨胀,被膜水肿,被膜附着物脱落,实质细胞凋亡,组织溶解。3.CDT致CD猪死亡和组织损伤：为了研究CDT对本动物的致病性,我们按10mg和20mg的剂量腹腔注射CD猪,同时取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑制备组织切片。结果发现20mg CDT致猪死亡,剖检呈现典型的革拉瑟氏病的病理变化：心包积液,大量的胸水和腹水,肺脏纤维素性渗出并与胸壁粘连,肝脏纤维素性渗出并与腹壁粘连等；而10mg CDT不致猪死亡,剖检发现仅在腹腔有少量的纤维素性渗出。组织切片结果显示20mg CDT致动物各脏器细胞变性肿胀,被膜增宽,随着细胞凋亡被膜脱落及组织形成空洞等,而10mg致病作用相对较弱。体内试验结果表明CDT是H. parasuis的毒力因子之一。4.cdt基因缺失突变株的筛选：根据NCBI公布的H. parasuis SH0165株基因组序列,设计特异性引物扩增cdt基因上下游同源臂,利用Overlapping PCR成功将上下游同源臂连接。将同源臂经双酶切后克隆到温度敏感质粒pSHK4TS,并电转到H. parasuis SH0165株。经过一轮筛选,获得cdt基因的单交换菌株,筛选了大约5000个CFU仍没有得到cdt基因缺失突变株。目前该工作仍在进行。本研究从体内和体外两方面证实了CDT是H. parasuis引起猪多发性浆膜炎的主要毒力因子之一,这为阐明该菌的致病机制奠定了基础。目前,cdt基因的敲除工作仍在进行,该工作的完善将有助于进一步阐述CDT在细菌致病机制中的作用。