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目的:观察糖尿病时不同时期正中隆起(ME)的室管膜细胞形态学变化,探讨该室周器官在糖尿病发病过程中的作用。
方法:选择雄性健康Wistar大鼠,体重200-220g,制备糖尿病模型。正常对照组(n=15);模型组分为四组:用药2周组(n=15):用药4周组(n=15);用药8周组(n=15);用药11周组(n=15)。
1.糖尿病模型制备:实验动物给予链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔一次性注射,60mg/kg,制备糖尿病模型。
2.光镜标本制备:常规经心灌注、固定、取脑,冠状方向去除视交叉以前和漏斗柄以后的部分,常规石蜡包埋,连续石蜡切片,片厚5um。常规HE染色、NF-KB免疫组化染色、封片。显微镜观察、照相。
3.扫描电镜标本的制备:麻醉、灌注方法同光镜标本制备,但灌注液为含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合磷酸缓冲液。灌注完毕取材,取下含有ME的脑块用PBS冲洗,置于磷酸缓冲液中。梯度酒精脱水,叔丁醇置换,真空干燥、喷金,日立S-3500N观察、照相。
4.透射电镜制备:透射电镜样品制备与扫描电镜样品制备相同,取下ME,放入4%戊二醛固定,1%饿酸后固定,树脂包埋,切片,T-S7500透射电镜观察、照相。
5.统计学处理:NF-KB阳性细胞采用麦克奥迪数码医学图像分析系统(Motic Med6.0)测定平均光密度。数据用均数加减标准差((x)±s)表示。应用SNK-q检验,进行两两比较,以P<0.05为有显著性差异。
结果:
1.大鼠在注射STZ后,第五天血糖值升高至30.0±1.34mmol/L,与对照组大鼠相比明显升高(P<0.05),提示糖尿病动物模型制备成功。
2.光镜观察结果:
2.1 正常对照组:ME室管膜细胞呈单层排列,胞核大小不一,呈圆形或椭圆形,ME内有丰富的毛细血管。
2.2 模型组:用药2周组,正中隆起处的室管膜细胞体排列密集,胞核萎缩,栅状带毛细血管稀疏;用药4周组,正中隆起中间部室管膜细胞排列密集,靠近第三脑室侧壁排列稀疏,栅状带毛细血管稀疏程度与糖尿病2周组无明显改变;用药8周组,正中隆起处室管膜细胞明显增多,呈多层排列,靠近第三脑室侧壁细胞增多明显;用药11周组,正中隆起处的室管膜细胞数目较八周组有所减少,细胞排列不规则,栅状带毛细血管稀疏程度与糖尿病2周组无明显改变,第三脑室侧壁细胞排列仍比较密集。
3.扫描电镜观察结果:
3.1 正常对照组:正中隆起处的分泌颗粒有明显的区域性,大小均匀,表面光滑,直径0.2-3.0μm。
3.2 模型组:正中隆起处的分泌颗粒分布区域、大小出现明显变化。2周组,分泌颗粒大小、分布均匀,颗粒不饱满,在交界区可见多个形态不一的吞噬细胞样室管膜上细胞。有的细胞表面有皱褶,有的细胞表面可见大量的分泌颗粒。4周组,分泌颗粒减少,漏斗隐窝处可见较小的分泌颗粒聚集成团状。8周组,靠近第三脑室侧壁交界区可见大量的分泌颗粒,大小不等,形态不一,也可见少量室管膜上细胞。11周组,分泌颗粒明显减少,集中在正中隆起中间部,呈窄长带状分布。靠近交界区可见丛密的微绒毛。
4.透射电镜观察结果:
4.1 正常对照组:室管膜细胞间紧密连接,细胞核形态多样,呈圆形、卵圆形或长条形。在室管膜细胞的脑室面可见处于不同状态的分泌颗粒,内容物为大小不等的空心囊泡和实心颗粒。
4.2 模型组:室管膜细胞分泌颗粒稀疏、变小,形态多样,多呈圆形、卵圆形;分泌颗粒内有的可见致密核心,有的可见较小的点状颗粒,有的可见稀少的小囊泡;室管膜细胞脑室面微绒毛稀疏,室管膜细胞内线粒体呈圆形、卵圆形,线粒体嵴模糊不清。
5.NF- KB免疫组织化学染色结果观察
5.1 正常对照组:正中隆起室管膜层可见少量的NF-κB表达阳性细胞,细胞呈棕黄色,呈杆状、椭圆形,平均光密度测定166.25±5.50。
5.2 模型组:2周组,正中隆起部位可见NF-κB免疫阳性细胞排列密集,并且免疫阳性细胞颜色加深,平均光密度测定185.77±6.02。4周组,免疫阳性细胞主要分布于室管膜层,平均光密度测定175.06±5.43。8周组,正中隆起处NF-κB免疫阳性细胞弥散分布,平均光密度测定176.32±7.22。11周组与正常组比较无明显差异,平均光密度测定167.13±5.38。
结论:
1.在扫描电镜下首次观察到正中隆起室管膜细胞的分泌颗粒在糖尿病大鼠的发病过程中有明显的区域差异。
2.糖尿病时正中隆起处NFκB阳性表达不同时期有显著性差异,平均光密度测定2周组表达水平最高,4周、8周组有所下降。
3.用STZ腹腔注射成功制备了糖尿病大鼠动物模型。