基于iTRAQ技术在特发性羊水过多患者差异蛋白质组学的研究

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目的:应用iTRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation,同位素标记相对与绝对定量)技术鉴定特发性羊水过多患者和正常妊娠孕妇羊水差异蛋白质组学,从而筛选出特发性羊水过多发生发展中发挥重要作用的调控蛋白和涉及的信号通路,为初步探讨其参与羊水调控机制提供新的思路。方法:(1)临床收集特发性羊水过多者3例和正常妊娠孕妇3例,于孕中期收集羊水,去除羊水中高峰度蛋白后进行蛋白酶解,使用iTRAQ肽段标记,高效液相及质谱检测、蛋白质鉴定和定量分析后得到羊水差异蛋白,经过生物信息学和文献查阅,筛选可能参与羊水循环动态平衡的候选蛋白。(2)临床收集20例妊娠晚期的特发性羊水过多者和20例妊娠晚期的正常孕妇的羊膜、绒毛膜、胎盘组织,应用蛋白免疫印迹方法检测CUL5、HIP1、FSTL3、LAMP2候选蛋白在羊膜,绒毛膜和胎盘上的表达水平。结果:(1)本研究在羊水中共鉴定出277989张二级图谱,5430条特有肽段序列,最终鉴定到1246个羊水蛋白。特发性羊水过多组和正常组比较,得到357个差异蛋白,其中282个上调蛋白和75个下调蛋白(筛选原则:上调比值>1.2 or<0.83,<0.05)。(2)生物信息学分析结果表明,GO(Gene Ontology,基因本体)分析发现差异蛋白主要富集在细胞、结合活性和单细胞生物过程等条目;KEGG通路分析发现差异蛋白主要富集通路为阿米巴病通路、造血细胞系通路和NF-kappa B信号通路等;组织富集分析,差异蛋白的组织表达谱主要来源于结肠、前列腺、肺、胎盘、睾丸、卵巢等组织;疾病富集分析发现差异蛋白表达多与2型糖尿病相关,慢性肾功能衰竭、肾功能衰竭、慢性前列腺癌症和动脉粥样硬化等疾病相关。经过生物信息学分析和文献查阅,筛选出26个可能参与调控羊水循环动态平衡的候选蛋白(<0.05),分别为:ANXA7、HIP1、RENI、FCG3A、CD59、SDCBP、LEP、CLIC5、NRP2、CRP、ARPC5、DYHC1、UPAR、RAB5B、COFA1、LEG3、LAMP2、FSTL3、PGBM、EPHB4、CD14、MYO6、LMAN2、PDC6I、CUL5、RAB35。(3)CUL5蛋白在特发性羊水过多患者的羊膜,绒毛膜中表达差异无统计学意义,在胎盘表达上调且差异具有统计学意义(<0.05);HIP1蛋白在特发性羊水过多患者的羊膜,绒毛膜上表达差异无统计学意义,但胎盘上表达下调且差异具有统计学意义(<0.05);LAMP2蛋白在特发性羊水过多患者的羊膜中表达上调,在绒毛膜表达上调,但是在胎盘表达下调,表达差异都具有统计学差异(<0.05);FSTL3蛋白在特发性羊水过多患者的羊膜,绒毛膜,胎盘中表达上调,差异具有统计学意义(<0.05),FSTL3可能在羊水平衡调控中起到重要作用。结论:本研究首次利用iTRAQ技术鉴定特发性羊水过多患者羊水蛋白组质学,利用生物信息学分析发现可能调节羊水循环的潜在蛋白和涉及的通路,为羊水量的调节机制提供研究基础。FSTL3蛋白在特发性羊水过多患者的羊膜,绒毛膜,胎盘中表达上调,差异具有统计学意义(<0.05),FSTL3可能在羊水调控中起到重要作用。
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