仙灵骨葆是临床上用于治疗骨科疾病的苗药制剂,收载于《国家基本药物目录》。自仙灵骨葆上市以来,治疗效果显著,但其不断增加的肝损伤不良反应报告也引起了社会各界的广泛关注,且目前仍然鲜有仙灵骨葆致肝损伤及其毒性作用机制的非临床研究报道。鉴于其肝损伤毒性特征、原因和作用机理等均不清楚,急需开展相关研究,为仙灵骨葆及含同类配方药物的安全监管和风险控制提供实验依据。本课题分别使用6周龄SD大鼠、12～13月龄雌性SD大鼠、免疫应激SD大鼠对仙灵骨葆的肝毒性进行评价,并从氧化应激、胆汁酸代谢等角度进行仙灵骨葆肝毒性机制探索,具体内容如下:通过重复灌胃给予6周龄SD大鼠仙灵骨葆8周实验,最高给药剂量相当于临床剂量的10倍,初步判断仙灵骨葆的肝毒性作用。病理学结果显示给药期间各组动物未出现与药物相关性肝损伤。使用12～13月龄雌性SD大鼠作为实验对象模拟中老年女性患者的生理代谢情况,重复灌胃给予12～13月龄雌性SD大鼠仙灵骨葆90天,最高给药剂量相当于临床剂量的20倍,研究仙灵骨葆重复给药对老年雌性大鼠的毒性反应。结果显示,给药组动物平均体重和平均摄食量较溶媒对照组显著性降低;脏器重量、血清生化和血液学检查未出现与药物相关性变化,大体病理学检查发现长期服用仙灵骨葆可能会促进动物胸腺萎缩,组织病理学检查未见与药物明显相关性病理学改变。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激SD大鼠产生免疫应激以增加其对肝损伤药物的敏感性。从LPS刺激剂量、联合给药顺序、解剖时间等方面对药物致免疫应激大鼠肝损伤模型进行探索和条件优化,最终确定LPS刺激剂量为0.1 mg/kg。使用LPS刺激前后分别给药的方法增加药物致肝损伤的发生率和敏感性,以血清生化变化为指标,确定末次给药12 h后为最佳解剖时间,通过控制给药时间减弱动物节律对实验结果的影响,并通过延长动物适应期和限制动物体重范围降低实验差异。使用8周龄免疫应激SD大鼠进行仙灵骨葆致急性肝损伤的探究。结果显示,仙灵骨葆能够引起免疫应激大鼠药物性肝损伤,损伤特征为血清转氨酶水平、总胆红素和甘油三酯等指标显著性升高,肝细胞坏死和单核细胞浸润是肝脏的主要病变类型,同时伴随出现库普弗细胞和肝星状细胞的明显活化和肝细胞凋亡。对仙灵骨葆致免疫应激大鼠急性肝损伤机制研究发现,氧化应激在仙灵骨葆致免疫应激大鼠急性肝损伤中发挥重要作用:仙灵骨葆可以诱导氧化型肝药酶CYP2E1、强氧化酶iNOS和NADPH氧化酶表达的增加,LPS通过引发机体的免疫应激反应,促进了肝脏库普弗细胞和肝星状细胞的活化,进一步增加iNOS和NADPH氧化酶表达量的增加,使得肝脏过量自由基生成,造成脂质过氧化,蛋白硝基化,最终导致肝脏细胞的凋亡和坏死,因此临床上治疗仙灵骨葆引起的急性肝损伤时可选用抗氧化的药物降低肝脏的氧化损伤程度。使用6周龄免疫应激大鼠SD大鼠进行仙灵骨葆重复给药肝损伤的探究。结果显示重复给予仙灵骨葆能够引起免疫应激大鼠肝损伤,损伤特点为血清转氨酶、总胆红素和甘油三酯等指标的显著性升高,肝细胞坏死和单核细胞浸润为肝脏的主要病变,且病变程度与药物剂量呈明显相关性。机制探索结果显示,仙灵骨葆能够促进胆汁酸合成限速酶CYP7A1的表达,并抑制CYP7A1胆汁酸负反馈调节蛋白法尼基衍生物X受体(Farnesyl X receptor,FXR)的表达,LPS诱导核因子κB(Nuclear Factorkappa-B,NF-κB)的表达间接抑制FXR的转录,LPS干扰胆汁酸转运体的表达,使得胆汁酸生物合成失调、转运紊乱引起免疫应激大鼠肝损伤,对于重复给药肝损伤的治疗除选择抗氧化剂治疗外,可加入胆汁淤积类药物对症治疗,以降低胆汁酸对肝脏的毒性作用。本课题从药物致肝损伤药物因素中的剂量因素、机体因素中的年龄因素和免疫因素角度进行仙灵骨葆致肝损伤研究,首次建立能够呈现仙灵骨葆致肝损伤毒性动物模型,并对仙灵骨葆致免疫应激大鼠急性和重复给药肝损伤的毒性机制进行探索,初步证明仙灵骨葆协同LPS引起的机体氧化应激和胆汁酸代谢紊乱在仙灵骨葆致免疫应激大鼠肝损伤中发挥重要作用。