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第一部分基于高通量测序构建口腔鳞状细胞癌中的microRNA-转录因子调控网络目的探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中,差异表达的microRNA（miRNA）和mRNA之间的调控关系,构建miRNA与转录因子之间的调控网络。材料和方法1.应用转录组高通量测序（mRNA-seq）检测4对OSCC组织-癌旁正常上皮组织中差异表达的转录组mRNA,并对差异表达的mRNA进行功能富集分析。2.应用小RNA高通量测序（miRNA-seq）检测4对OSCC组织-癌旁正常上皮组织中差异表达的miRNA。3.构建OSCC组织中差异表达的miRNA和mRNA间的负向变化关系对,应用miRanda和Target Scan软件预测差异表达miRNA的潜在靶基因,并进一步筛选每对组织中负向变化的miRNA-预测靶向mRNA对（上调miRNA-下调靶向mRNA/下调miRNA-上调靶向mRNA）。4.将负向变化的miRNA-预测靶向mRNA对中上调的mRNA和下调的mRNA进行功能富集分析,研究OSCC中差异表达的miRNA和mRNA之间的功能关系及对OSCC产生的影响。结果1.MRNA-seq结果显示,在8个OSCC或癌旁正常组织样本中,每个样本检测到的转录组mRNA的表达数为21977-24584个。每对OSCC-癌旁正常组织中分析出3042-6776个差异表达mRNA。与癌旁正常组织相比,4对OSCC组织中有183个mRNA共同上调、185个mRNA共同下调。上调mRNA主要富集于肿瘤增殖、侵袭相关的信号通路,如有丝分裂、纺锤体构成等;下调mRNA主要富集于正常上皮生物功能相关的信号通路,如角质细胞分化、转录调控、细胞凋亡等。2.MiRNA-seq结果显示,有1034-2067个miRNA在8个OSCC或癌旁正常组织样本中表达。每对OSCC-癌旁正常组织中分析出120-268个差异表达miRNA。4对OSCC-癌旁正常组织中有17个miRNA共同上调、1个miRNA共同下调。3.MiRanda和Target Scan软件预测结果显示,2617个差异表达miRNA预测有16968个靶基因。其中,我们总共识别了8137个负向变化的miRNA-靶向mRNA对,涉及到213个差异表达miRNA和2172个差异表达mRNA。4.功能富集分析结果显示,4对OSCC-癌旁正常组织的负靶向对中,下调mRNA均主要富集于转录相关信号通路;上调mRNA富集于细胞增殖、细胞迁移、血管生成等信号通路,不同组织间存在个体差异,无明显规律性。我们选择上调的133个miRNA-下调的168个转录因子的负调控关系构建了OSCC的miRNA-转录因子调控网络图。结论OSCC中差异上调的miRNA主要通过下调转录因子来调控转录相关信号通路,以影响肿瘤发生进程;从而构建了OSCC中的miRNA-转录因子调控网络。第二部分口腔鳞状细胞癌中microRNA协同抑制生物钟基因RORA的表达目的探讨在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）的microRNA（miRNA）-转录因子调控网络中,5个预测靶向维甲酸孤核受体A（Retinoic acid receptor-related orphan receptor,RORA）的miRNA对其协同抑制作用。材料和方法1.在OSCC的miRNA-转录因子调控网络里选取的miRNA-RORA子网中,根据人类细胞miRNA测序数据,将预测靶向RORA的25个miRNA进一步筛选相应的miRNA进行后续研究。2.通过q PCR反应检测44对OSCC-正常组织中RORA的mRNA表达水平和38对OSCC-正常组织中预测靶向RORA的5个miRNA（miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p和miR-183-5p）的表达水平。3.利用p Si CheckTM-2双荧光素酶载体构建插入了RORA 3’UTR（包含5个miRNA结合位点）的载体p Si CheckTM-2-RORA 3’UTR。应用双荧光素酶实验验证5个miRNA对RORA的直接靶向抑制作用。4.将5个miRNA的inhibitor单个、两两或者五个一起转入Hela细胞中。利用q PCR检测各组细胞内RORA的mRNA水平,检测5个miRNA对RORA的协同抑制作用。结果1.OSCC的miRNA-转录因子调控网络的下调转录因子中包含了多达4个生物钟基因（RORA、RORB、RORC和CLOCK）,并被多个miRNA同时靶向调控。其中RORA被报道在许多肿瘤中表达下调,能通过抑制增殖发挥抑癌作用,遂选择miRNA-RORA子网进行研究。靶向RORA的25个miRNA在人类细胞miRNA测序数据中显示,其中8个miRNA可能与巨噬细胞浸润相关。去除这8个miRNA,其余的17个miRNA中我们选择了与肿瘤增殖密切相关的miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p和miR-183-5p进行后续研究。2.QPCR结果显示,与癌旁正常组织相比,RORA在44对OSCC组织中呈现普遍而显著的下调（36/44,84.1%）;5个预测靶向RORA的miRNA——miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p和miR-183-5p在38对OSCC组织中也呈现普遍的下调（20/38,52.6%;26/38,68.4%;20/38,52.6%;30/38,78.9%;23/38,60.5%）。3.双荧光素酶实验结果显示,转入了miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p和miR-183-5p的mimic组与对照组相比,荧光值分别下降了49.4%、15.5%、49.8%、39.0%和46.3%;它们的inhibitor组与对照组相比,荧光值分别上调了34.7%、41.7%、87.2%、16.1%和60.4%。4.QPCR结果显示,与对照组相比,转入单个miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p或miR-183-5p的inhibitor组的RORA mRNA水平分别增加至1.2倍、1.3倍、1.1倍、1.2倍和1.1倍;两两转入的miRNA inhibitor组的RORA mRNA水平明显增加;转入5个miRNA inhibitor组的RORA mRNA水平比对照组增加至4.9倍（p<0.001）。结论OSCC中5个上调的miRNA（miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p和miR-183-5p）能靶向抑制下调抑癌生物钟基因RORA的表达,且5个miRNA能协同发挥更强的抑制作用。第三部分RORA的异常表达影响口腔鳞状细胞癌的增殖和预后目的探讨OSCC中异常表达的维甲酸孤核受体A（Retinoic acid receptor-related orphan receptor,RORA）对增殖和预后的影响,以及RORA抑癌可能的分子机制。材料和方法1.利用TCGA数据库里340例OSCC组织和32例癌旁正常组织中RORA的mRNAseq数据和临床资料,分析OSCC中RORA的mRNA水平表达模式及其与OSCC病人预后的关系。采用免疫组化实验检测125例OSCC组织芯片中RORα蛋白的表达,分析其蛋白水平表达模式及其与患者临床病理及预后的关系。2.利用慢病毒重组质粒构建稳定过表达RORA基因的OSCC细胞系Cal-27/UMSCC-23-p CDH-RORA（以空白质粒Cal-27/UM-SCC-23-p CDH-puro作为对照）以及稳定敲减RORA基因的OSCC细胞系Cal-27-GV-248-RORA-sh1/2/3（以空白质粒Cal-27-GV-248-con作为对照）。3.利用q PCR和western blot实验检测Cal-27/UM-SCC-23-p CDH-RORA细胞以及Cal-27-GV-248-RORA-sh1/2/3细胞中RORA在mRNA水平和蛋白水平上的过表达或敲减效率。4.利用CCK-8细胞增殖实验和裸鼠植瘤实验检测RORA的过表达或敲减在OSCC中对增殖活力的影响。5.利用western blot实验检测在Cal-27细胞系中稳定的敲减或过表达RORA后,在HIPK2/p53信号通路中p53蛋白、p53-Ser46蛋白和HIPK2蛋白的表达变化。6.利用p Si Check TM-2双荧光素酶载体构建含有RORA结合位点的p53启动子序列的载体p Si Check TM-2-p53;并构建相应的突变载体p Si Check TM-2-p53-mut。应用双荧光素酶实验检测RORA对p53启动子的靶向结合作用。7.利用免疫沉淀实验在Cal-27细胞中检测RORA蛋白与HIPK2蛋白的相互结合作用。结果1.TCGA数据库中,RORA在OSCC组织中的mRNA水平明显低于癌旁正常组织（p<0.001）,且OSCC组织中RORA mRNA低表达者的三年生存率明显低于高表达者（p=0.0456）。在125例OSCC组织芯片中,OSCC组织中的RORα蛋白水平明显低于癌旁正常组织（p<0.001）,且OSCC组织中RORα蛋白低表达者表现出更激进的临床分期（p<0.05）与病理分级（p<0.01）,且RORα蛋白低表达者的五年生存率明显低于高表达者（p=0.0265）。2.与对照组相比,在过表达RORA的Cal-27细胞系和UM-SCC-23细胞系中,RORA的mRNA表达水平分别升高至903.6倍和156.2倍（p<0.001）;RORα的蛋白表达也明显升高。在敲减RORA的Cal-27细胞系中,与对照组相比,Cal-27-GV-248-RORA-sh1/2/3中RORA的mRNA水平下降了3.13、2.37、2.40倍（p<0.001）;RORα的蛋白表达也明显下降。3.CCK-8实验显示,RORA过表达后的Cal-27细胞和UM-SCC-23细胞与对照组相比,96h时细胞增殖活力分别降低了48%和34%（p<0.01）;RORA敲减后的Cal-27细胞与对照组相比,96h时细胞增殖活力分别增长至1.68倍、1.42倍和1.51倍（p<0.01）。裸鼠植瘤实验显示,注射Cal-27-p CDH-RORA细胞的裸鼠的肿瘤增长速度、肿瘤重量与肿瘤体积均显著小于对照组（p<0.05）。4.在Cal-27-p CDH-RORA细胞中,p53蛋白、p53-Ser46蛋白和HIPK2蛋白的表达量比对照组明显增高;在Cal-27-GV-248-RORA-sh1/2/3细胞中,p53蛋白、p53-Ser46蛋白和HIPK2蛋白的表达量比对照组明显下降。5.双荧光素酶实验结果显示,p Si CheckTM-2-p53质粒组的荧光值与对照组相比,增长至2.34倍（p<0.05）;p Si CheckTM-2-p53-mut质粒组的荧光值与对照组相比无明显差异,是其1.21倍。6.免疫沉淀实验结果显示,用RORα抗体所结合的Cal-27蛋白中,检测到了HIPK2蛋白;HIPK2抗体所结合的Cal-27蛋白中,检测到了RORα蛋白。结论RORA在OSCC中的表达量显著降低,且在OSCC患者中RORA表达量越低预后越差。下调的RORA可能是促进OSCC增殖的重要因素之一。RORα可能通过影响p53和HIPK2来发挥抑癌作用。