TteRRF,AmCBL1初步晶体学和嗜热菌ATCC27502-ATP合酶晶体生长研究

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核糖体循环因子(RRF)是一种催化蛋白质合成全过程(起始,延伸,终止和翻译后复合体)中翻译后复合体的解体的蛋白。由于腾冲嗜热菌RRF (TteRRF) C-端的截短体和一些嗜温菌RRF在非允许温度下拯救大肠杆菌温度敏感突变体(frrts)表现出不同的特性,为了从分子结构上阐明这些现象,就需要对这些分子的精细结构有更明确的认识。将TteRRF构建入原核表达载体pET-DB,经过Ni亲和层析,离子交换层析,和分子筛层析纯化后经化学修饰,用于晶体生长并得到了用于衍射的单晶,衍射数据经过处理后衍射分辨率为2.8A,空间群为P6122/P6522,晶胞参数为a=103.264A,b=103.264A,c=89.173A,α=90.000,β=90.000,γ=120.000。ATP合成酶(FOF1-ATPase)是一个广泛存在各种生物膜上的马达蛋白,它在质子电化学梯度驱动下合成ATP,又可以利用ATP驱动质子的跨膜运输。它是一个跨膜的超分子复合体,原核生物的ATP合成酶有水溶性部分F1和跨膜的F0两部分组成,F1包括α3β3γδε, F0包括ab2cn。目前大部分的亚基结构已经解析,只有a亚基和b亚基的C端没有高分辨率的结构,另外整个全酶这个膜蛋白复合物没有完整的结构报道。本文选用了极端嗜热菌ATCC27502 F0F1-ATPase作为研究对象,天然提取了完整的F0F1-ATPase, SDS-PAGE显示纯度为70%以上,有高水解ATP活性,动态光散射检测为比较均匀的单体,用悬滴法筛选晶体,得到了微晶,为晶体进一步优化提够了基础。钙调神经磷酸酶B样蛋白1(CBL1)是一种植物钙信号的传导器,它把钙信号传递给他的下游分子,CBL相互作用蛋白激酶23(CBL interaction protein kinase23, CIPK23)。CBL1和CIPK23信号转导途径,在植物应答逆境环境(例如,低钾,渗透压,盐胁迫,冷冻和干旱)中起了重要作用。将截短的沙冬青CBL1 (AmCBL1Δ17)野生型基因及其突变基因构建入pET-22b(+)载体,转化入BL21 (DE3)过表达,经过Ni柱亲和层析,DEAE离子交换层析和分子筛层析纯化后筛选晶体,其中突变体AmCBL1Δ17-123衍射能力最好,收到一套2.9A的衍射数据,数据经过处理,该晶体的空间群为P21212,晶胞参数为a=99.87 A,b=114.42 A,c=63.80A,α=β=γ=90.00。
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