TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）,即定向诱导基因组局部突变技术作为一个高通量、低成本、全新的反向遗传学研究方法,被广泛应用于基因功能的研究。TILLING技术的核心是使用单链核酸内切酶大规模筛选突变体库。CEL I酶作为第一个从植物芹菜（Apium graveolens）中发现的核酸内切酶,因其能够高效特异地识别双链DNA中碱基突变形成的错配,并能从错配碱基的3’端进行有效切割而被大量应用于TILLING技术中检测目的基因的点突变。CEL I酶的基因序列已经报道（GeneBank Accession: AF237958）。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是很成熟的真核基因表达系统,从1988年开发至今已成功表达300多种各类蛋白质。本研究对CEL I酶蛋白在毕赤酵母系统中的表达做了初步研究,为进一步获得到高纯度、高活性和稳定表达的CEL I酶蛋白奠定基础。同时对建立利用芹菜CEL I酶粗提液筛选大豆疫霉菌EMS诱变突变体库的体系做了探索。 研究结果显示,利用RT-PCR技术,从芹菜总RNA中反转录扩增到长度为888bp的CEL I基因的ORF全长序列,引入His-tag标签后基因被重组到酵母分泌表达载体pPIC9K和pPICZαB中,经转化毕赤酵母KM71H和GS115菌株获得了候选重组子,PCR筛选和Mut表型鉴定的阳性重组子通过甲醇诱导表达后,SDS-PAGE结果显示,分泌表达的蛋白中出现约45kDa的预期条带;Western印迹结果进一步确证其为目标蛋白。研究结果显示利用真核表达系统已成功表达重组的CEL I酶蛋白,为进一步检测酶活性并应用于TILLING技术中奠定了基础。 研究结果表明,从芹菜中提取到了有活性的CEL I酶粗提液,以大豆疫霉菌的PsPMA1（plasma membrane H+-ATPase 1）基因为目标,通过筛选大豆疫霉菌EMS诱变突变体库,初步建立了大豆疫霉菌突变体库的筛选体系。