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线粒体是细胞内氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ATP）合成的主要场所,在调节氧化还原稳态、能量产生、细胞周期和细胞凋亡等功能中发挥重要作用。由线粒体动力学介导的线粒体稳态对于细胞维持正常的生物学功能至关重要。线粒体动力学通过调节裂变与融合之间的平衡来调节细胞的状态与功能,通过裂变过程分离受损的线粒体,通过融合过程在健康线粒体之间进行物质交换。裂变与融合之间的平衡调节着线粒体的数量、大小和在细胞质内的定位,而平衡紊乱将导致线粒体功能障碍,表现为ATP生成减少、ROS产生增多、细胞能量代谢、增殖、凋亡等表型异常和疾病发生。然而,线粒体在感知细胞内外环境刺激时,有哪些重要因子参与了线粒体动力学稳态变化的调控过程?它们是如何调控线粒体动力学稳态平衡,又是如何通过调控动力学稳态来调控细胞的适应与存活能力的?这些均是亟待回答的科学问题。针对以上科学问题,我们利用CRISPR-Cas9 sg RNA文库对影响线粒体分裂与融合稳态平衡和重要细胞功能的因子进行了筛选,结果我们筛选到了调控线粒体分裂与融合稳态平衡的ABRA因子和SIDBA2因子,并发现ABRA因子在介导辐射抵抗中的功能以及SIDBA2因子在调控氧化应激中的功能。第一部分:新型线粒体动力学稳态调控因子ABRA在辐射中的功能研究辐射时产生的ROS介导的细胞损伤是射线杀伤细胞的关键因素,也是决定细胞辐射敏感性的重要原因。线粒体是细胞内产生活性氧ROS的主要场所,调控其功能可作为增加放疗敏感性的新策略。线粒体分裂融合平衡对于维持线粒体和细胞的功能具有重要作用,调控这一平衡可影响细胞对辐射的敏感性。尽管线粒体在辐射中起着决定细胞命运的关键作用,但在放射生物学领域,线粒体融合与分裂动态平衡和功能的精细调节与放疗敏感性之间的关系却并不十分清楚。我们通过CRISPR-Cas9 sg RNA文库筛选,发现ABRA基因敲除,线粒体分裂增多,辐射条件下的细胞存活减少。我们猜测ABRA基因可能参与了线粒体分裂融合稳态和辐射敏感性调控。通过剂量递增法构建了辐射抵抗（IR resistance,IR-R）MCF-7细胞系。通过克隆形成实验、流式细胞术检测IR-R MCF-7细胞与辐射敏感（IR sensitive,IR-S）细胞在细胞存活、凋亡及ROS的差异。结果证实,在辐射条件下IR-R MCF-7细胞克隆形成率及细胞存活率均高于IR-S MCF-7细胞,而凋亡率及ROS水平均低于IR-S MCF-7细胞,说明成功构建了辐射抵抗的IR-R MCF-7细胞系。随后,我们提取IR-S及IR-R细胞总RNA,进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,筛选放疗抵抗与敏感株之间的差异基因。结合实时定量逆转录聚合酶链反应（Quantitive Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）验证差异基因,确定在辐射抵抗中表达较高的基因。结果发现,RNA-Seq与RT-PCR结果中差异表达最高的上调基因均为ABRA。为了确定ABRA在辐射中的功能,我们通过克隆形成、生存曲线测定、细胞凋亡流式检测和细胞内ROS水平检测ABRA与辐射敏感性之间的关系。结果显示,辐射条件下ABRA敲低可减少克隆形成率、细胞生存率,增加细胞凋亡与ROS水平,而敲低ABRA再回复后,克隆形成率与细胞生存率增加,细胞凋亡率与ROS水平降低,说明ABRA能够介导放疗抵抗。由于线粒体是决定辐射敏感性的重要因素,前述筛选结果提示,ABRA敲除细胞的线粒体分裂增多。因此,我们检测了ABRA在辐射前后对线粒体功能的影响。通过海马高通量分析检测了ABRA基因对线粒体耗氧率的影响,通过流式细胞技术检测了线粒体膜电位水平变化,通过丙二醛（MDA）含量检测确定了ABRA对细胞内脂质过氧化物水平的改变。结果显示,辐射条件下ABRA敲低导致线粒体耗氧率下降、线粒体膜电位水平下调、脂质过氧化物水平增加、同时促进线粒体裂变。当敲低ABRA再回复后线粒体耗氧率回升,线粒体膜电位水平增加,脂质过氧化物水平下调。利用Mito-tracker线粒体探针染色与透射电镜观察线粒体分裂与融合的形态变化,结果显示,敲低ABRA线粒体裂变增多,当敲低ABRA再回复后线粒体裂变情况有所好转,说明ABRA通过调节线粒体分裂与融合稳态及线粒体功能来促进辐射抵抗。由于ABRA在辐射抵抗细胞系中表达升高,为了进一步研究ABRA在辐射条件下表达升高的机制,我们利用RT-PCR以及Western-blot对照射后细胞ABRA的转录及蛋白水平进行了分析。经一定剂量的照射后,MCF-7和A549两种细胞中ABRA的转录与蛋白水平均升高。通过荧光素酶活性实验确定了调节ABRA的上游转录因子为c-Jun并确定了c-Jun结合位点为-300 bp～-400 bp。通过加入c-Jun抑制剂T-5224验证了其对线粒体裂变融合、细胞克隆形成、细胞活性以及ROS的调节作用。结果显示,T-5224抑制c-Jun后ABRA表达水平下降、线粒体裂变增加、细胞克隆形成率降低、细胞存活率下降、ROS水平升高,说明c-Jun能够通过ABRA调节线粒体功能影响辐射敏感性。接下来,我们利用小鼠荷瘤实验验证了c-Jun/ABRA轴在体内对放疗敏感性的调节作用。结果显示,抑制c-Jun/ABRA轴导致局部放疗后小鼠肿瘤体积显著降低。对瘤组织进行Tunel染色,结果显示,c-Jun/ABRA抑制组的凋亡水平较高,当ABRA回复后,小鼠成瘤体积增加,Tunel结果显示出较低的凋亡水平,说明c-Jun/ABRA轴能够在体内介导放疗抵抗性。利用临床标本进行免疫组化染色,确定了ABRA在放疗敏感与抵抗患者中的表达量高低,以及与c-Jun表达水平的相关性。结果显示,ABRA在肺癌及乳腺癌放疗敏感的患者组织中低表达,在肺癌及乳腺癌放疗抵抗的患者中高表达,同时c-Jun与ABRA的表达呈正相关。通过分析GEPIA网站中TCGA收集的乳腺癌患者与肺癌患者数据,我们发现在未接受放疗的患者中ABRA高表达与低表达两组之间的OS和RFS无显著差异（P＞0.05）。然而,在接受了放疗的患者中,ABRA高表达的患者OS和RFS显著低于ABRA低表达的患者。说明ABRA是肿瘤放疗治疗的特异性标志物,ABRA高表达预示着患者预后较差。结论:c-Jun/ABRA轴在调节线粒体融合与分裂稳态和介导放疗抵抗中起重要作用,加入c-Jun抑制剂或抑制ABRA能够改善和增加放疗敏感性。第二部分:线粒体动力学稳态调控因子SIDBA2在氧化应激中的作用研究利用CRISPR-Cas9 sg RNA文库对影响线粒体分裂与融合稳态平衡和重要细胞功能的因子进行筛选,我们筛选到了SIDBA2基因。SIDBA2属于溶质载体转运体家族成员,位于线粒体内膜上,主要负责将甘氨酸转运至线粒体。然而,SIDBA2基因发挥的生物学功能以及SIDBA2表达异常的生理病理学意义未有报道。筛选结果显示,SIDBA2敲除后线粒体分裂明显增多,细胞存活率下降、OCR下降,我们猜测SIDBA2在线粒体动力学稳态、线粒体能量代谢和细胞稳态调控中一定发挥重要功能。首先我们建立了SIDBA2基因全身敲除小鼠模型,采集杂交后子代小鼠的鼠尾进行PCR小鼠基因型鉴定,繁殖几代后发现子代小鼠中无纯合子,说明纯合子可能在胚胎期死亡。我们从杂合子与杂合子交配后怀孕的母鼠体内剖取小鼠胚胎,结果发现,同一母胎生出的小鼠胚胎中,SIDBA2野生型或杂合子剖出时存活,而SIDBA2敲除纯合子小鼠胚胎色泽苍白,剖出时已死亡,说明SIDBA2基因在调节机体正常生理功能中的重要作用。分离SIDBA2敲除小鼠纯合子MEF细胞,通过Mito-tracker染色观察SIDBA2全敲小鼠纯合MEF细胞的线粒体形态,并通过Western blot检测线粒体融合蛋白Mfn1和分裂蛋白Drp1的表达水平变化,结果发现全敲除SIDBA2小鼠纯合MEF细胞的线粒体形态异常,成圆圈状,线粒体融合蛋白Mfn1水平降低,分裂蛋白Drp1水平增加,说明线粒体融合与分裂稳态受到影响。为研究SIDBA2对线粒体功能的影响,我们通过CRISPR-Cas9法构建SIDBA2ZR75-1敲除细胞系,并对敲除细胞系进行测序及蛋白水平验证,证实敲除细胞系构建成功。我们通过海马高通量法检测了野生型与SIDBA2敲除组细胞的耗氧率,通过流式细胞术检测线粒体膜电位水平与ROS水平,同时检测了脂质过氧化物水平及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值改变。结果显示,SIDBA2敲除组细胞的耗氧率降低,线粒体膜电位水平及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值下调,ROS水平与脂质过氧化物水平升高,说明线粒体功能受损。随后,我们构建了SIDBA2条件性敲除小鼠并获得了在肝脏特异性敲除SIDBA2的小鼠。利用脂多糖（LPS）联合D-半乳糖胺（D-Gal N）法建立肝氧化应激损伤模型,结果发现,与对照组相比,肝脏特异性敲除SIDBA2的小鼠对LPS/D-Gal N诱导的肝氧化应激损伤更加敏感,说明SIDBA2具有对抗氧化应激损伤的能力。为进一步研究SIDBA2调控线粒体动力学稳态的分子机制,我们利用质谱对于SIDBA2相互作用的蛋白进行筛选,结果发现了线粒体融合蛋白Mfn1与之相互作用。免疫共沉淀实验验证结果表明,SIDBA2与Mfn1之间存在相互作用。为进一步验证SIDBA2调控细胞线粒体动力学稳态是否通过Mfn1,我们将Mfn1敲低,再检测SIDBA2对细胞线粒体功能的调控作用,结果发现,当SIDBA2过表达后细胞内线粒体膜电位增加,当Mfn1被敲低后细胞内线粒体去极化的比例显著下降,当Mfn1被敲低后过表达SIDBA2细胞内线粒体膜电位无明显回升,这说明SIDBA2调控细胞线粒体功能部分依赖于Mfn1。结论:SIDBA2在调节线粒体融合与分裂稳态和对抗氧化应激损伤中起重要作用。