血管内皮细胞增殖分化调控机制的研究是烧伤、创伤后创面愈合和修复的重要组成部分，也是皮肤组织工程研究的重要理论基础。研究表明，多种生长因子参与了血管内皮细胞增殖分化的调控，但是尚不清楚这些生长因子间的相互作用关系和生物学意义，原因是在信号转导水平我们还不能完全解释血管内皮细胞增殖分化的调控机制。我们前期发现：人钙调素依赖的丝氨酸蛋白激酶(CASK)可以抑制细胞增殖， CASK作为分化抑制因子1(Inhibitor of differentiation 1，Id1)的上游信号分子参与了血管内皮细胞增殖分化的调控。基于转录及转录后调控，Id1存在两种不同的拼接型：Id1蛋白和Id1’蛋白。我们前期实验表明：CASK与Id1’的结合活性远大于Id1。Id1可促进细胞增殖、抑制分化，主要通过负向调控bHLH转录因子而发挥生物学作用。bHLH分为两类：A类几乎在所有的组织和细胞中表达；B类具有组织特异性，目前已在肌肉、神经等系统中发现组织特异的转录因子。Id1还可通过与非bHLH类蛋白的结合，调控细胞的增殖分化。血管内皮细胞是否存在特异性bHLH或未知的非bHLH类蛋白与Id1或Id1’相结合，目前尚不清楚。为此，我们利用酵母双杂交技术筛选与Id1’相互作用的蛋白，免疫共沉淀方法在人血管内皮细胞中证实酵母双杂交所获结果的真实性。主要研究内容和结果如下：采用PCR方法，扩增出Id1’的编码序列，利用DNA重组技术将Id1’的编码序列定向克隆入酵母双杂交诱饵载体pHybLex/Zeo，并经酶切和测序鉴定证实重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1’构建成功。醋酸锂法将pHybLex/Zeo-Id1’转化入酵母菌株EGY48/pSH18-34中，涂于YC-UZ200平板上，30℃倒置培养3天，转化株生长良好，显示pHybLex/Zeo-Id1’表达的融合蛋白对酵母细胞的生长无毒性作用。酵母转化株在缺陷培养基YC-ULZ200上不能生长，表明融合蛋白无非特异性激活报告基因Leu2的功能。β-半乳糖苷酶克隆滤膜影印分析显示融合蛋白无非特异激活报告基因LacZ功能。为进一步筛选文库中与Id1’相互作用的蛋白奠定了基础。按照成人肺组织cDNA文库说明书确定文库滴度为2.1(1010cfu/ml，碱裂解法抽提文库质粒，获得高质量的文库质粒2ml，OD260/OD280为1.96，浓度为1.1(g/(l。文库质粒的纯度和浓度可以满足电转化至酵母菌的需要。用电穿孔法依次将重组诱饵质粒和成人肺组织cDNA文库质粒依次转化入酵母株中，经初步筛选，获得198个Leu+克隆。β-半乳糖苷酶克隆滤膜影印分析获得19个<WP=8>Leu+、LacZ+双阳性克隆。抽提双阳性克隆的文库质粒，分别与质粒pHybLex/Zeo-Id1’、pHybLex/Zeo-Lamin、pHybLex/Zeo转化入酵母株中，检测这些转化株报告基因的激活情况，以排除假阳性克隆。最终获得2个真阳性克隆。将2个真阳性质粒测序，通过Internet与GeneBank进行同源性比较，结果发现其中一个是酪氨酸蛋白激酶Fyn，目前尚无资料报道Id1’与Fyn存在相互作用。另一个是与Id1’相互作用的未知蛋白(Homo sapiens hypothetical protein FLJ10283)，将其命名为Id1’ 相关因子( Id1’ related factor，IDRF)。利用生物信息学方法对IDRF蛋白进行结构域预测，认为IDRF蛋白可能通过FHA结构域参与细胞周期检查点调控、DNA损伤修复；通过G-patch结构域在介导RNA-蛋白结合过程中起作用。推测Id1’-IDRF经非bHLH途径对细胞的生物学行为进行调控。我们利用RT-PCR方法，设计引物分别在成人肺组织和人血管内皮细胞中扩增出IDRF的cDNA序列，证实IDRF在人血管内皮细胞ECV304中有表达。由于酵母双杂交可能存在假阳性结果，必须用其它方法进行验证，以保证结果的真实性。本课题采用免疫共沉淀方法验证Id1’与IDRF相互作用的真实性。RT-PCR方法扩增IDRF的编码序列，并克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN2上，酶切证实重组质粒pEGFPN2-IDRF构建成功。将质粒pEGFPN2-IDRF转染入人血管内皮细胞ECV304细胞中，转染后48h，提取ECV304细胞的总蛋白，用Id1’抗体沉淀的蛋白复合物中，EGF抗体检测到融合蛋白的存在；对于转染空质粒pEGFPN2的ECV304细胞，EGF抗体不能检测到 Id1’抗体沉淀的蛋白复合物中存在与Id1’相结合的蛋白，在人血管内皮细胞中证实Id1’与IDRF确实存在相互作用。