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内皮依赖性超极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor, EDHF)是除NO和PGI2外血管内皮细胞合成分泌的第三种舒张血管的物质。目前,在多种属、多部位的血管中都发现存在EDHF反应,但血管中,尤其是在脑血管中,EDHF到底是哪种物质还不清楚。杜鹃花总黄酮(total flavones of Rhododendra,TFR)是从植物杜鹃花中提取的有效部位,本实验室曾发现TFR的抗心脑血管损伤的作用,本实验拟对其抗心脑血管损伤作用的部分机制进行探讨。目的:1.探讨大鼠基底动脉的EDHF反应;2.研究在大鼠基底动脉中,H2S是否具有EDHF样作用;3. TFR对大鼠基底动脉的扩张作用及其EDHF机制研究;4. TFR抗心肌缺血损伤时对iNOS表达的影响。方法:1.采用离体微血管舒缩功能测定实验,检测ACh对基底动脉的舒张作用、基底动脉的EDHF反应、PPG对EDHF舒张作用的影响、NaHS及L-cys对血管的舒张作用、TFR对血管的舒张作用及其EDHF机制。实验结束后,收集各组血管管腔内灌流液,用以检测H2S的含量。2.细胞膜电位记录实验,研究ACh对大鼠基底动脉平滑肌细胞膜电位的超极化作用及内源性和外源性EDHF的超极化作用。3.原代培养大鼠基底动脉内皮细胞,采用RT-PCR的方法检测内源性合成硫化氢的酶的表达,并观察ACh及TFR对酶表达的影响。4.在体结扎冠脉前降支致心肌缺血损伤模型,TFR预处理给药,检测心肌梗死面积、血清中cTnI、NO含量,western blot方法检测心肌组织中iNOS的蛋白表达水平。结果:1.在离体血管舒缩功能测定实验中,用30 mmol/L的KCl或10-7 mol/L的U46619预收缩的大鼠基底动脉,ACh均可产生浓度依赖性的舒张作用,其最大舒张率分别是80.97±1.27 %和80.84±5.10 %,与溶媒对照组比较差异有显著性(P<0.01);而去除血管内皮后,ACh的舒张作用消失。2.应用NO合酶抑制剂(L-NAME,3×10-5mol/L)和PGI2合酶抑制剂(Indo,10-5mol/L)后,ACh对基底动脉还存在部分舒张作用,其最大舒张率分别是31.51±3.55(KCl)%和38.87±3.48(U46619)%,与溶媒对照组比较差异有显著性(P<0.01);在细胞膜电位记录实验中,应用L-NAME和Indo后,ACh对大鼠基底动脉平滑肌细胞的超极化作用并未被完全抑制,其最大超极化作用为-63.11±4.47 mV,与溶媒对照组比较差异有显著性(P<0.01)。此结果表明,在大鼠基底动脉中,这种非NO、非PGI2、内皮依赖的超极化及舒张血管作用可能为EDHF的作用。3.在离体血管舒缩功能测定实验中发现,10-5-10-2.5mol/L NaHS(H2S外源性供体)可产生浓度依赖性的舒张作用;同时,在细胞膜电位记录实验中也发现,10-5-10-2.5mol/L NaHS具有浓度依赖性超极化血管平滑肌细胞的作用。4.在离体血管舒缩功能测定实验中发现,内源性合成硫化氢的酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)的阻断剂DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG, 10-4mol/L)可以抑制EDHF引起的血管舒张作用,与未用阻断剂组比较差异有显著性(P<0.01);同样,在细胞膜电位记录实验中也发现,PPG可以明显抑制EDHF对基底动脉平滑肌细胞的超极化作用,与不加阻断剂组相比差异有显著性(P<0.05 or P<0.01)。5.在离体血管舒缩功能测定实验中发现,合成硫化氢的底物L-半胱氨酸(L-cysteine,L-cys, 10-5-10-2.5mol/L)可产生浓度依赖性的舒张作用;去除血管内皮后L-cys的舒张作用被部分抑制。6.在离体血管舒缩功能测定实验中,收集血管内腔灌流液,用来检测H2S的含量,结果显示大鼠基底动脉基础状态下就有H2S的产生,其含量为3.92±0.25×10-5 mol/L,用ACh联合L-NAME,Indo灌流结束后H2S的含量有明显的增加,与基础含量比较差异有显著性(P<0.01),而加用PPG(10-4mol/L)预灌后H2S的含量明显降低(P<0.01)。7.在原代培养的大鼠基底动脉内皮细胞中,采用RT-PCR的方法检测合成硫化氢的酶的表达,结果显示,血管内皮细胞中表达CSE而不表达CBS;而且ACh(10-4.5mol/L)可以上调基底动脉内皮细胞中CSE的表达。8.在离体血管舒缩功能测定实验中发现,TFR(0.011～2.7g/L)对大鼠基底动脉具有明显的浓度依赖性舒张作用;去除血管内皮细胞后,TFR的舒张作用被部分抑制;在血管内腔灌流液中用L-NAME(3×10-5mol/L)和Indo(10-5mol/L)预灌30min后,TFR舒张作用被部分抑制。结果表明在TFR舒张基底动脉的作用中除NO和PGI2外,尚有EDHF机制的参与。9.在离体血管舒缩功能测定实验中,用L-NAME(3×10-5mol/L),Indo(10-5mol/L)和PPG(10-4mol/L)同时预灌30min后,TFR舒张作用被部分抑制,与仅用L-NAME和Indo预灌组比较差异有显著性;TFR灌流结束后,血管内腔灌流液中H2S的含量有明显的增加,与基础生成量比较差异有显著性,联合L-NAME, Indo预灌组,H2S的含量较基础生成量也明显增加,而加用PPG预灌后H2S的含量则明显降低。RT-PCR半定量结果显示,TFR(2.7g/L)可以上调大鼠基底动脉内皮细胞CSE的mRNA表达水平,与溶媒对照组比较,差异有显著性(P<0.01)。此结果进一步提示,在TFR扩张基底动脉的机制中有EDHF作用的参与。10.在结扎冠脉前降支致心肌缺血损伤模型中发现,TFR预处理具有明显的抗心肌缺血再灌注损伤的作用,可以降低心肌梗死面积,明显抑制急性心肌梗死造成的血清中cTnI的升高,增加血清中NO含量,上调心肌组织中iNOS的蛋白表达水平。结论:1.大鼠基底动脉中,乙酰胆碱可产生非NO、非PGI2、内皮依赖的超极化及舒张血管作用,即EDHF反应;2.在原代培养的大鼠基底动脉内皮细胞中,有内源性合成的酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)的表达,而且CSE的抑制剂可以抑制这种非NO、非PGI2、内皮依赖的超极化及舒张血管作用,同时发现NaHS(H2S外源性供体)具有超极化及舒张血管的作用,提示H2S可能是大鼠基底动脉中的EDHF;3. TFR对大鼠基底动脉具有明显的舒张作用,而且TFR对大鼠基底动脉的扩张作用中有EDHF作用的参与,此作用可能是TFR其抗脑缺血损伤的机制之一;TFR可通过增强iNOS基因的表达,增加NO的水平,从而起到抗心肌缺血损伤的作用。