食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率高且疗效差。目前手术和放疗是食管癌的主要治疗手段。近年来随着诊疗技术的提高和不断改进，食管癌患者的生存率有了提高，但是疗效仍不尽人意，5年生存率仍徘徊在15%左右。术后和放疗后的局部复发和转移是影响食管癌患者预后的主要因素。因此深入研究食管癌局部浸润和转移的机制并探索有效的治疗措施，对食管癌的防治具有重大意义。近年来许多研究发现，低氧是实体肿瘤中存在的一种普遍现象，是其微环境的基本特征之一。作为一种应激源，低氧能激活肿瘤细胞内的一系列基因作出应答反应，使很多基因转录活性发生改变，其基因产物可引起肿瘤细胞发生一系列生物学行为的改变。目前研究表明，肿瘤细胞为了在低氧环境中保持能量供应，不仅促血管生成能力极大提高，对于放化疗的抗拒性增加，其侵袭性还极大增强，更易于发生远处转移，从而导致治疗失败。在这一过程中，低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-l）起着关键作用，但其复杂的作用机制目前还不十分清楚。HIF-l作为低氧环境中起中枢纽带作用的转录因子，已成为近年来的研究热点。HIF-l是由HIF-lα和HIF-lβ两个亚单位组成的一种异源二聚体。常氧条件下，HIF-lα很容易被降解，其途径是泛素-蛋白水解酶复合体；而在低氧条件下，降解过程被阻断，导致HIF-1α积聚，并与HIF-1β形成活性形式，影响多种靶基因的表达。HIF-l靶基因结构上均含有低氧反应元件（hypoxia response element, HRE），HRE是被调控基因的启动子或增强子中包含的一段特定的核苷酸序列，其核心序列是5，-RCGTG-3，。活化的HIF-1与其靶基因的HRE结合后，形成转录起始复合物，调节靶基因的转录。由于HIF-lα在低氧诱导肿瘤细胞发生的一系列适应性反应中发挥着重要作用。因此，深入研究HIF-lα与肿瘤的侵袭和转移的关系有着重要意义。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是近些年发现的一种反义基因技术，自1998年Fire等首次发现以来，迅速应用于基因功能的研究。RNAi技术是将目的基因所对应的小分子双链RNA导入靶细胞内，导致其相应的mRNA降解，从而阻断特定基因的表达。本研究首先通过观察体外CoCl₂诱导低氧对食管癌细胞中HIF-1α、E-钙黏蛋白及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响，采用哺乳动物雷帕霉素靶向（mTOR）通道阻断剂—雷帕霉素（rapamycin）进行干预，检测Eca109细胞迁移和侵袭能力的变化，探讨低氧对食管癌迁移及侵袭能力的影响及其作用机制；其次，通过脂质体介导、质粒连接HIF-1α短发卡状RNA（short hair RNA,shRNA）的RNAi技术，检测HIF-1α沉默对食管癌Eca109细胞迁移能力的变化，以及E-钙黏蛋白、MMP-2及Snail的表达情况，进一步探讨其具体的分子作用机制；最后，通过建立裸鼠移植瘤模型，探讨RNAi沉默HIF-1α对食管癌Eca109细胞体内侵袭转移能力的影响。第一部分低氧对食管癌Eca109细胞体外迁移及侵袭的影响目的：探讨低氧对食管癌迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法：采用CoCl₂化学低氧法模拟肿瘤低氧微环境，半定量RT-PCR和免疫细胞化学分别检测不同低氧时相时食管癌Eca109细胞中HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2mRNA及蛋白的表达。Western blot检测rapamycin联合低氧处理Eca109细胞后，HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2蛋白的表达变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测rapamycin联合低氧对Eca109细胞迁移及侵袭能力的影响。结果：Eca109细胞在低氧状态下，HIF-1αmRNA无明显变化，仅蛋白表达增多；E-钙黏蛋白的mRNA表达明显降低（P<0.05），同时蛋白表达减少；MMP-2mRNA表达明显升高（P<0.05），蛋白表达也增多。Rapamycin在低氧状态下可显著抑制HIF-1α及MMP-2表达，促进E-钙黏蛋白高表达。经相关性分析，E-钙黏蛋白与HIF-1α呈负相关（r=-0.834，P<0.05）。MMP-2表达与HIF-1α呈正相关（r=1.000，P<0.01）。经rapamycin处理后，Eca109细胞在低氧条件下，迁移速度减慢，侵袭穿膜细胞数减少（P<0.05）。结论：低氧使Eca109细胞中HIF-1α蛋白表达增多，后者可能通过下调E-钙黏蛋白、上调MMP-2表达促进食管癌在低氧状态下的迁移及侵袭。第二部分HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体的制备和稳定转染食管癌Eca109细胞的建立目的：构建HIF-1αRNA干扰慢病毒载体，筛选HIF-1α基因稳定沉默的Eca109细胞株，检测HIF-1α沉默对食管癌Eca109细胞迁移能力的变化，以及E-钙黏蛋白、MMP-2及Snail的表达情况，进一步探讨其分子作用机制。方法：设计3对HIF-1α基因的反义寡核苷酸片段和一对无义序列，经过退火及酶切后，克隆入RNA干扰表达载体pGCSIL，体外扩增纯化后，得到重组构建的pGCSIL-HIF-1α-shRNA干扰表达载体；通过脂质体2000介导将pGCSIL-HIF-1α-shRNA干扰表达载体转染食管癌Eca109细胞，利用G418筛选稳定表达株；采用RT-PCR、Western blot方法检测转染pGCSIL-HIF-1α-shRNA的Eca109细胞中HIF-1α表达水平的变化；应用transwell体外细胞跨膜迁移实验检测转染pGCSIL-HIF-1α-shRNA的Eca109细胞迁移能力的变化。采用Western blot方法检测HIF-1α沉默后，E-钙黏蛋白、MMP-2及Snail的表达情况。结果：RT-PCR鉴定结果表明成功构建了3个shRNA表达载体pGCSIL-HIF-1α-shRNA1，pGCSIL-HIF-1α-shRNA2和pGCSIL-HIF-1α-shRNA3，并筛选出抑制效果最佳的shRNA表达载体pGCSIL-HIF-1α-shRNA2；在转染pGCSIL-HIF-1α-shRNA2组Eca109细胞中HIF-1α显著低于无关siRNA对照组及未转染组（P<0.05）；Transwell体外迁移实验结果显示：pGCSIL-HIF-1α-shRNA2转染组Eca109细胞穿越微孔的细胞数明显减少（P<0.05），而无关siRNA对照组及未转染组Eca109细胞无明显差异（P>0.05）。有效沉默HIF-1α表达后， E-钙黏蛋白表达增强、MMP-2表达减弱（P<0.05）。低氧条件下，Snail蛋白表达水平升高，但在转染pGCSIL-HIF-1α-shRNA2组Snail表达明显减弱。经相关性分析，HIF-1α与Snail呈正相关（r=0.840，P<0.05）。结论：成功建立质粒连接的HIF-1α shRNA，并筛选出比较理想的HIF-1αshRNA转染质粒。采用慢病毒包装系统包装质粒，生产高滴度的病毒液，感染食管癌Eca109细胞株后，HIF-1α在mRNA及其蛋白水平均明显下降。成功构建了人基因HIF-1α蛋白低表达的食管癌细胞株。利用HIF-1α shRNA转染Eca109细胞后，Eca109细胞的迁移能力明显减弱。干扰HIF-1α表达后，Eca109细胞中E-钙黏蛋白表达明显增加，其分子机制可能与HIF-1α下调后，Snail蛋白表达随之减少有关。同时，MMP-2表达降低，其作用机制有待进一步深入研究。第三部分RNA干扰HIF-1α基因表达对裸鼠移植瘤侵袭转移的作用及机制研究目的：建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤的成瘤性，以及HIF-1α基因对Eca109细胞体内侵袭转移能力的影响。方法：分别将pGCSIL-HIF-1α-shRNA转染组、无关siRNA对照组及未转染组的食管癌Eca109细胞株注入裸鼠皮下，比较各组裸鼠的成瘤情况及肿瘤大小。应用HE染色检测各组裸鼠两侧腹股沟淋巴结的转移率及阳性率。应用RT-PCR和Western blot分别检测各组裸鼠移植瘤中HIF-1α、E-钙黏蛋白、MMP-2mRNA及蛋白的表达情况。结果：在对照组及未转染组中，其裸鼠移植瘤的体积显著大于RNAi组，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组和未转染组相比，RNAi组裸鼠淋巴结转移率及阳性率明显降低。在RNAi组裸鼠移植瘤组织中，HIF-1α、MMP-2mRNA及蛋白表达明显降低，而E-钙黏蛋白mRNA及蛋白表达明显升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论：体内实验显示，采用RNAi技术降低HIF-1α基因表达，可有效抑制裸鼠移植瘤的生长，并能降低食管癌Eca109细胞的侵袭和转移，其机制可能与封闭HIF-1α基因表达后，E-钙黏蛋白表达上调、MMP-2表达下调有关，为食管癌的靶向治疗提供了新的思路及理论依据。