论文部分内容阅读
本研究从广东不同水体鱼鲺的流行病学调查入手,首先对鱼鲺的种类和地理分布、宿主类型、感染率和感染强度等展开研究;然后通过扫描电镜观察对所发现的15种鱼鲺进行了超微结构的研究,以便寻找新的分类标准;最后采用分子分类方法对来自不同国家的同一种鱼鲺(Argulus sp.)mtDNA三种基因(cox1,nad1和nad4)的遗传差异进行了研究。
为了对广东省鱼鲺分布进行全面调查,我们将本省划分成3大区27个点,以便精确地了解该研究范围内存在哪些鲺种。为了收集到各种环境的虫体,包括来自宿主的或水面游离的以及附在水下物体上的虫体,采样时我们运用了多种方法,如刺网,延绳钓,诱钓,浮游生物网,定置张网以及拖网捕鱼。然后参照Margolis等(1982)的公式计算出鲺的流行率,虫荷及鲺在宿主身上的平均密度和感染水平。结果显示,广东鲺的分布非常广泛,90%以上的水体中含有此虫。此外,本次调查共发现15种鲺,其中7种为中国新记录,14种为广东省首次报道。本次调查共收集1011个鱼鲺,其中65.77%来自感染鱼,29.67%是游离的虫体,4.54%来自水下物体,且雌鲺的数量几乎是雄鲺的两倍。其中日本鲺(A.japonicus),白鲑鲺(A.Coregoni),叶形鲺(A.foliaceus)占大多数,所调查的27个点都发现了日本鲺,总感染率为12.56%,最高感染强度为127。从不同的水体比较,171个鲺来自河流,其中蒙古鲺(A.mongolisnus)最多,数量为34个,占19.88%。314个鲺采自水库、湖泊和池塘,其中大鲺(A.major)有29个,数量最多,占9.23%。在没有经过处理的渔场鲺的数量和种类最多。鲺的宿主特异性尚不确定。鲺的感染率和感染强度主要受季节以及鱼的繁殖期的影响,在广东夏季是感染的高发季节。
采用XL 30扫描电子显微镜对鱼鲺的超微结构进行了观察。其方法有两种:一是先用无水乙醇对样本进行脱水,再于临界点下干燥,干燥后,虫体表面镀上金膜,采用扫描电子显微镜(SEM)观察;二是用蒸馏水将样本的粘液和碎片洗净,在4℃下用4%戊二醛磷酸缓冲液固定24-30h,然后用1%磷酸缓冲液洗脱,再用蒸馏水冲洗,最后采用环境扫描电子显微镜(ESEM)观察。结果发现广东省的鲺种存在明显差异,并揭示出一个新的可靠的分类标准,以往未曾发现或采用。本研究中我们首次利用ESEM描绘了12种鲺的超微结构特征,我们确信一些特征是以前用光学显微镜无法观察到的。比如第二触角丛(位置,数量,刚毛长度和形状,鞭节形状和范围),几丁质条形状(滴状,梳状,带几个尖头的叉状,折扇状或刷状)以及在第二上颚上的分布,棘的形状(指状,矛状和圆柱状),游泳足(有无鞭毛,分节和鳞片形状),第一颚杆的几丁质条形状(细长,卵圆形,有隔,含有横线),口前刺和游泳足的刚毛。这些特征都是鉴别虫种的理想指标。而且,副性交配器官的位置和结构,吸盘周缘上重叠几丁质条的数量和结构(基部几丁质条如花瓶状,圆锥状或杯状),雄性的黑色素斑,第二游泳足的结构,虫体的整体大小,都是用来区分雌雄鲺的最重要的标准。
在分子分类研究中,我们采用PCR技术对虫体线粒体DNA(mtDNA)的三个基因,即细胞色素C氧化酶亚单位1(cox1),NADH脱氢酶亚单位1和亚单位4(nad1和nad4)进行了扩增与测序,研究了来自中国、叙利亚和埃及三国日本鲺的遗传差异,通过MEGA 4.0利用mtDNA基因构建了日本鲺的第一个系统树。每个样品经SDS或蛋白水解酶K处理后,再进行纯化(Wizard SV基因组纯化系统),萃取其全基因组DNA。然后设计3对引物扩增虫体cox1基因部分序列(pcox1)、nad1基因和nad4基因部分序列(pnad1和pnad4),这些虫体来自中国、埃及和叙利亚的感染鱼。然后对其PCR产物进行测序。结果显示,cox1基因上A+T含量为68.8%-69%,nad1基因为77.1%-77.6%,had4基因为60.4%-60.9%。所有日本鲺中,在cox1基因上的序列变异为0.1.9%,nad1基因为0-2.3%,nad4基因为0-0.8%。不同河流的日本鲺在cox1基因上的序列变异为0.4.%-0.8%,nad1基因为1%-2.3%,nad4基因为0.4%-0.8%。而所有渔场的日本鲺在cox1基因上的序列变异为0.6%-1.9%,nad1基因为0-1.7%,nad4基因为0.2%-0.6%。所选的遗传标记中,nad1是变异最大的基因,nad4基因比cox1基因更保守。所有日本鲺的分离株都是A.ameTicanus在系统树上的姊妹株,且属于同一分支,来自中国和埃及渔场的分离株相距最近。然而,日本鲺个体间存在适度的遗传漂移和突变。这些发现证实所选的3个mtDNA基因为日本鲺种群遗传学的研究提供了便利,其中nad1基因是检测日本鲺序列变异的一种新的可靠的遗传标记。