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慢性乙型肝炎病毒(HBV)是危害人类健康的难题之一,目前全球至少有3.6亿乙型肝炎病毒感染者,其中超过三分之一的人群在中国,这些人群面临着发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的高风险。由于慢性乙型肝炎患者对病毒产生不同程度的免疫耐受,以及HBV共价互补环状DNA(cccDNA)在肝内的持续存在,现有的抗病毒药物如干扰素(IFN)和拉米夫定等核苷类似物,只能一定程度抑制HBV的复制,最终达不到彻底清除HBV的效果,而且尚有一大部分慢性乙肝患者对上述抗病毒治疗无应答,因此发展更为有效的抗病毒药物是十分迫切。通常情况下,病毒感染后会通过一系列机制激活免疫系统从而被清除,特别是病毒感染早期诱导表达Ⅰ型干扰素(IFN-α/IFN-p),I型干扰素不仅能诱导大量的抗病毒蛋白,而且可以激活固有免疫和适应性免疫系统从而发挥抗病毒作用。浆细胞样DC (Plasmacytoid dendritic cells,pDCs)是诱导干扰素-α(IFN-α)表达的主要天然免疫细胞,pDCs通过其胞内的TLR样受体(Toll-like receptors,TLR)包括TLR7和TLR9分别识别病毒的单链RNA和非甲基化的CpG (cytidine phosphate guanosine oligodeoxynucleotides) DNA从而启动下游级联信号,大量分泌Ⅰ型干扰素。而HBV是一种双链DNA病毒,在其基因组上我们发现也存在CpG序列,那么HBV是否可以通过自身CpG触发TLR9信号从而启动下游干扰素活化途径进而清除病毒呢?基于以上问题考虑,本研究首先筛选HBV基因组来源的CpG,即HBV-CpG,探讨其诱导IFN-α表达的能力,在研究过程中还发现HBV基因组中存在富含鸟苷的抑制性寡核苷酸(ODN),即HBV-ODN,这些抑制性HBV-ODN可特异性抑制HBV-CpG诱导的IFN-α表达。进一步研究发现纳米材料PEG-PLA包裹的HBV-CpG,即NP(HBV-CpG),能拮抗HBV-ODN对IFN-a产生的抑制作用,同时探讨了NP(HBV-CpG)在预防和治疗乙型肝炎病毒感染中的作用。在本研究中,我们首先设计了一系列HBV基因组来源的CpG序列即HBV-CpG,利用ELISA和流式细胞术的方法筛选出能诱导健康人PBMCs高表达IFN-α的HBV-CpG;之后,我们设计了HBV基因来源的富含鸟苷的抑制性HBV-ODN, ELISA方法验证其对HBV-CpG诱导IFN-α表达的能力具有特异性抑制作用,免疫荧光技术探讨了抑制性HBV-ODN的抑制机制；双乳化法将纳米材料包裹HBV-CpG形成NP (HBV-CpG), ELISA方法验证NP(HBV-CpG)逆转抑制性HBV-ODN介导的抑制活性,ELISA和流式细胞术进一步检测NP(MBV-CpG)诱导乙肝病人PBMCs表达IFN-a的情况；在小鼠模型中,利用流式细胞术检测野生型小鼠淋巴细胞的活化情况,放射性免疫法及ELISA法检测NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗接种野生型小鼠后的抗体应答；利用高压注射pAAV/HBV1.2质粒构建HBV携带小鼠模型,流式细胞术和ELISA法检测淋巴细胞的活化以及Ⅰ型IFN的表达,放射性免疫法检测NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗治疗后HBsAg和HBsAb的表达,荧光定量PCR技术检测联合治疗后HBVDNA的表达情况,免疫组化法检测联合治疗后肝脏HBcAg表达情况,H＆E染色、转氨酶及胆红素检测观察肝脏损伤情况,流式细胞术内标IFN-γ检测特异性CD8+T细胞的活化。通过上述研究方法,我们获得了以下研究结果：1. HBV-CpG诱导人pDCs细胞高表达IFN-a首先我们设计了一系列HBV基因组来源的CpG序列,将其分别刺激健康人PBMCs, ELISA检测上清IFN-α的表达,由此筛选出高表达IFN-α的HBV-CpG,进一步流式细胞术验证HBV-CpG是通过诱导Lineagel-, CD123+, HLA-DR+的细胞即pDCs特异性表达IFN-α,流式内标发现HBV-CpG刺激PBMCs后pDCs胞内TLR9表达上调,TLR7表达没有显著变化,内体酸化抑制剂氯喹处理后抑制了HBV-CpG诱导的IFN-α的表达。以上结果证明了HBV-CpG诱导人pDCs表达IFN-α,依赖TLR9而非TLR7的途径。2. inhibitory HBV-ODN特异性抑制HBV-CpG诱导的IFN-a的表达在HBV基因组上我们同时发现了一些富集鸟苷的序列,ELISA法证明这些序列具有特异性抑制HBV-CpG诱导IFN-a表达的能力,该抑制性序列命名为HBV-ODN。我们也发现这些抑制性HBV-ODN并不能抑制广谱CpG-2216诱导的IFN-a的表达,为了进一步证明HBV-ODN的抑制机制,我们应用免疫荧光技术发现HBV-ODN抑制了Gen2.2细胞对HBV-CpG的摄取及与TLR9的共定位。因此我们认为抑制性HBV-ODN特异性抑制了HBV-CpG诱导的IFN-a的表达。3. NP(HBV-CpG)逆转HBV-ODN抑制IFN-α的表达能力为了逆转HBV-ODN的抑制效应,我们采用纳米材料PEG-PLA包被HBV-CpG,即形成NP(HBV-CpG),当NP(HBV-CpG)与HBV-ODN以2：1的比例刺激PBMCs时,IFN-α的表达显著提高,而且NP(HBV-CpG)比HBV-CpG具有更强的活化pDCs、NK和T细胞的能力,进一步研究发现NP(HBV-CpG)同样可以诱导乙肝患者来源的PBMCs表达IFN-α。根据以上结果我们证明HBV-CpG在纳米材料包被下可以逆转HBV-ODN抑制IFN-a的能力并且可以诱导乙肝患者PBMCs表达IFN-α。4. NP(HBV-CpG)活化野生型小鼠的淋巴细胞小鼠体内试验中,通过静脉注射NP(HBV-CpG)可以显著提高pDCs和cDCs表面CD40和CD80的表达,以及上调NK和T细胞表面CD69和ICOS的表达。NP(HBV-CpG)体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞,同样提高了pDCs和cDCs表面CD40和CD80以及NK和T细胞表面CD69的表达,而且pDCs和cDCs在NP(HBV-CpG)刺激下生存能力增强。以上结果证明NP(HBV-CpG)体内体外均具有活化小鼠淋巴细胞的能力。5. NP(HBV-CpG)协同增强乙肝疫苗的抗体应答NP(HBV-CpG)联合rHBsAg疫苗分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,同时设空载体联合rHBsAg疫苗组、单独乙肝疫苗组和未处理组做对照,免疫2和4周后放射性免疫法检测发现,NP(HBV-CpG)联合rHBsAg疫苗组抗体应答水平显著提高,ELISA检测发现Thl型抗体亚型IgG2a水平也显著增强。上述结果证明NP(HBV-CpG)增强乙肝疫苗的抗体应答特别是Th1型抗体应答。6. NP(HBV-CpG)促进HBV携带小鼠的免疫应答将pAAV/HBV1.2质粒高压注射C57BL/6小鼠,构建HBV携带鼠模型,NP(HBV-CpG)静脉处理HBV携带鼠显著提高了cDCs表面CD40和CD80, NK细胞表面CD69和ICOS,以及CD4+和CD8+T细胞CD69的表达,并且NP(HBV-CpG)尾静脉注射HBV携带鼠诱导了血清中IFN-α的表达。以上结果证明NP(HBV-CpG)具有活化HBV携带鼠免疫应答的能力。7. NP(HBV-CpG)联合治疗有效清除HBV利用上述高压注射构建的HBV携带鼠模型,探讨NP(HBV-CpG)对于乙肝病毒的清除作用,将NP(HBV-CpG)联合rHBsAg疫苗治疗HBV携带鼠,经过连续三周的治疗,90%的HBV携带鼠血清HBsAg被清除,肝脏HBcAg和血清HBVDNA表达显著下降,保护性乙肝抗体HBsAb开始表达,并且表达IFN-y的CD8+T细胞上调,提示NP(HBV-CpG)促进了CTL功能,同时肝脏H&E染色显示肝脏结构正常,仅有轻微炎性浸润,血清转氨酶和胆红素检测进一步证明HBV携带鼠对这种NP(HBV-CpG)联合治疗是耐受的。根据以上结果我们证明了NP(HBV-CpG)联合治疗HBV携带鼠可以在短期内有效清除HBV,并且促进保护性抗体的产生。