萨罗罗非鱼是一种耐盐性极强的罗非鱼品种,自然分布于西非从象牙海岸到塞内加尔的港湾、泻湖等广大水域。尼罗罗非鱼新吉富品系是在吉富的基础上群体选育而成的新品种,耐盐性弱,在淡水中具有生长速度快的优点。两者在分类上不同属,自然条件下不能交配,为了充分利用我国丰富的咸、海水资源,本研究室通过人工繁殖获得杂交后代,具有较好的生长速度和较强的耐盐性能的优点。Na+-K+-ATPase酶alpha 1亚基(NKAa1)、Na+/K+-2Cl共转运子1 alpha亚基(NKCC1a)、胰岛素样生长因子-1b亚基(IGF-Ib)和催乳素-I基因(PRL-I)等是与耐盐渗透调节密切相关的基因,本文以萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交F1为实验材料,在耐盐性能比较的基础上,对上述四个基因的序列组成、分子结构及转录后mRNA表达差异进行了比较系统的研究,以期对萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼的耐盐遗传机理进行有益的探索,为耐盐罗非鱼新品种的选育和推广提供必要的理论支持。主要研究结果如下:一萨罗、尼罗及杂交F1耐盐性能的比较以萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1及杂交F2为实验材料,从淡水零盐度开始,实验组每天提高水体8个盐度,直到实验鱼全部死亡,对四种遗传型罗非鱼的累积存活率(CS)和50%死亡盐度(MLS)进行比较,结果表明:(1)经过15天的慢性耐盐实验,萨罗罗非鱼的MLS约为125.78±1.66,尼罗罗非鱼的MLS约为54.22±2.51,杂交F1和F2的MLS值分别约为77.33±1.89和73.73±1.32。萨罗罗非鱼耐盐性能显著高于尼罗罗非鱼及杂交后代,而杂交后代耐盐性能也显著高于尼罗罗非鱼,杂交F1与F2之间的耐盐性能没有显著差异。(2)萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交后代第一尾鱼死亡的盐度分别为96、40和56,到最后一尾鱼死亡时盐度分别为136,80和96,间隔时间分别为6天、5天和5天。二萨罗、尼罗及杂交F1 NKAa1基因克隆、序列分析及mRNA表达差异根据GenBank中莫桑比克罗非鱼的NKAa1基因序列设计了1对引物,通过PCR扩增获得萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1 NKAa1基因的部分保守序列,ii根据所获得的序列,设计了6对RACE引物,分别进行3`RACE扩增和5`RACE扩增,得到萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1 NKAa1基因cDNA全长序列;设计一对qRT-PCR引物,用SYBR荧光染料检测其mRNA表达差异。实验结果表明:(1)萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1 NKAa1基因cDNA序列全长分别为3227bp、3257bp和3223bp,萨罗罗非鱼和尼罗罗非鱼核苷酸相似度为95.76%,与杂交F1相似度为97.73%,而尼罗罗非鱼与杂交F1相似度为93.92%。开放阅读框(ORF)长度为3072bp,编码1023个氨基酸,萨罗罗非鱼与杂交F1的氨基酸相似度为98.3%,尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼及杂交F1氨基酸相似度均为97.65%。(2)聚类分析表明杂交F1 NKAa1基因比较偏向于萨罗罗非鱼。(3)萨罗罗非鱼Ser519不同于尼罗罗非鱼和杂交F1,导致该位点附近NKAa1基因蛋白质二级结构发生了改变;萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1 NKAa1基因含8个跨膜螺旋结构域(TM),其中TM1~4和TM7~8在所有同源物种中的分布都非常保守,但是TM5~6的分布差异较大,尼罗罗非鱼F916和T917两个氨基酸残基的突变,可能是其跨膜螺旋分布差异的原因。(4)淡水条件下,NKAa1基因在尼罗罗非鱼肝脏中的表达量最高,在肠道中表达量最低;而萨罗罗非鱼鳃、肠、肾中表达量显著的高于肝,杂交F1也是肠道中表达量最低,但是差异不显著;在致死盐度下,尼罗罗非鱼鳃和肠组织中NKAa1 mRNA表达量显著上升,而肝组织和肾组织中表达量则显著下降,萨罗罗非鱼鳃中NKAa1 mRNA的表达受盐度影响极其显著,致死盐度下鳃NKAa1表达量(19.821±3.951)接近为淡水条件下表达量(1.054±0.185)的20倍,杂交F1鳃肝肠肾中表达量均随着盐度上升而增加,但是差异不显著。三萨罗、尼罗及杂交F1NKCC1a基因克隆、序列分析及mRNA表达差异Na-K-2Cl 1alpha亚基是维持鳃丝氯细胞渗透压平衡的关键离子转运器,以1Na+:1K+:2Cl-的比例进行电中性跨膜转运。本文关于NKCC1a基因的研究结果如下:(1)从萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1鳃丝组织中分离出NKCC1α基因cDNA全长序列,全长分别为3 832bp、3 819bp和3 827bp,其开放阅读框长3 456bp,编码1 151个氨基酸残基。多重比对和聚类分析结果表明,本研究获得的基因序列与莫桑比克罗非鱼、鲑及鳗鲡的NKCC1α最为相似,其中,与莫桑比克罗非鱼相似性最高(>99%)。(2)预测萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交F1的NKCC1α蛋白质二级结构包含10个跨膜螺旋,这些跨膜螺旋的氨基酸序列及其分布在所有硬骨鱼类中都非常保守。(3)应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测鳃、肝、肠、肾NKCC1αmRNA相对含量,淡水条件下,萨罗罗非鱼鳃中的相对表达量最高,显著高于肝、肠和肾中的表达量;尼罗罗非鱼和杂交F1是肾脏中相对表达量最高,差异极其显著;盐度显著影响NKCC1α在萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交F1鳃组织中的表达,在致死盐度下NKCC1αmRNA相对表达水平分别为0盐度下的4.9倍、13.9倍和8.8倍,差异极显著(P<0.001),显示NKCC1α基因与三种遗传型罗非鱼耐盐适应密切相关。(4)在肠组织中,尼罗罗非鱼的NKCC1a基因mRNA相对表达量随盐度增加而显著升高,杂交F1则恰好相反,结果说明在高渗环境中它们可能具有不同的渗透压调节机制,尼罗罗非鱼更接近淡水鱼类的调节模式。(5)萨罗罗非鱼与杂交F1三个突变氨基酸残基位点S252、L398和M409导致其空间结构与尼罗罗非鱼不一致,可能与三者的耐盐差异有关。四萨罗、尼罗及杂交F1IGF-Ib基因克隆、序列分析及mRNA表达差异应用3`RACE克隆技术,分别从萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1的鳃的总RNA中获得其IGF-Ib基因的部分cDNA序列,对三种遗传型罗非鱼的IGF-Ib基因的研究结果表明(:1) IGF-Ib基因序列长度分别为1076bp、1075bp和1079bp,包含完整的开放阅读框(ORF)546bp、一个终止密码及含polyA信号的3`UTR,尚缺5`UTR序列;其ORF编码182个氨基酸,包括信号肽(44aa),成熟肽B区(29aa)、C区(10aa)、A区(21aa)、D区(8aa)及编码70aa的E区,二级结构分析为混合类型。(2)同源基因多重比对表明,三种遗传型罗非鱼的IGF-Ib基因与其他脊椎动物IGF-Ib基因序列的相似度达75.8%～100%。成熟肽A、B区高度保守,C区第82位后缺失2aa, E区第131位和159位分别缺失3aa和1aa;(3)萨罗罗非鱼在E肽133位发生Ala/Pro氨基酸残基替换,与耐盐性强的莫桑比克罗非鱼和画眉罗非鱼一致,推测IGF-Ib基因E区选择性剪切与三种罗非鱼耐盐性能差异有关。(4)淡水条件下,萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交F1 IGF-Ib基因都是主要在肝脏中表达,但是在致死盐度下,耐盐性弱的尼罗罗非鱼肠道中含量最高,且极显著的高于淡水零盐度下表达量,而鳃、肝、肾中相对含量均显著降低;杂交F1和耐盐性强的萨罗罗非鱼在致死盐度下鳃中的含量均显著升高,但是杂交F1肝、肠、肾中含量均显著降低。五萨罗、尼罗及杂交F1 IPRL-I基因克隆、序列分析及mRNA表达差异采用常规基因克隆和RACE相结合,从萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1鳃组织中得到PRL-I基因cDNA部分序列,对三种遗传型罗非鱼的PRL-I基因编码区的序列结构及mRNA表达进行分析,结果表明: (1)本研究得到萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1的PRL-I部分cDNA核苷酸序列分别为1444bp、1449bp和1499bp,包括较短的5`UTR序列、保守的编码区和比较长的3`UTR序列。开放阅读框序列长639bp,编码212个氨基酸和一个终止密码(TAA),编码区包括信号肽(24aa)和成熟肽(188aa)。(2)序列比对显示萨罗罗非鱼与杂交F1的ORF组成完全一致,二者与尼罗罗非鱼氨基酸相似度为99.5%,尼罗罗非鱼第2号(R2)和第46号(S46)残基发生突变,可能与它们的耐盐性能差异有关。(3)成熟肽的4个半胱氨酸残基在所有物种中都高度保守,同源比对结果显示,E29、M132、K140和L186等四个氨基酸残基为罗非鱼鱼类的特异性残基。(4)PRL-I基因在鳃、肝、肠、肾组织中都有表达,淡水条件下尼罗罗非鱼肠中的含量最低,但是与其它三种组织中的表达量相比差异不显著;而萨罗罗非鱼以肝和肠中含量最高,与鳃和肾之间有显著差异;杂交F1肝中的含量极显著高于鳃、肠和肾。(5)在致死盐度下,尼罗罗非鱼肠道中mRNA相对含量达到淡水条件下的30倍,肝脏中含量也显著上升;萨罗罗非鱼鳃中的含量在致死盐度下比在淡水条件下显著升高;杂交F1在鳃中的含量前后变化不明显,在肝和肠中含量显著下降,但是在肾中的含量却显著升高,结果显示三种遗传型罗非鱼的PRL-I在不同盐度下有不同的调节模式。