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背景:SIRT2(Silent information regulator 2)是NAD~+依赖性的去乙酰化酶,它是Sirtuins家族的重要成员之一。SIRT2它不仅主要存在于细胞质中,还可以移位至细胞核中发挥其相关的功能作用。最近的研究表明,SIRT2参与多种细胞过程,其中包括能量代谢、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞老化和代谢、基因组的稳定性、炎症、寿命和肿瘤的发生等。在过去的几年中,已经鉴定出许多SIRT2的蛋白底物,SIRT2能使多种蛋白底物去乙酰化并参与许多细胞过程,其中包括炎症的调节。然而,其在炎症过程中的确切作用尚未完全阐明。我们之前的研究结果发现了与SIRT2相互作用的新的底物蛋白热休克蛋白(Heat Shock Protein 90,Hsp90?),在此基础上进行研究和探索SIRT2与Hsp90?之间的相互作用以及探索对其下游炎性因子表达的调控作用机制。为今后开发靶向SIRT2调节与炎症相关疾病的免疫应答提供了新理论依据和治疗思路。目的:我们在前期已经鉴定出SIRT2新型底物蛋白Hsp90的基础上,进一步验证SIRT2与热休克蛋白Hsp90之间的相互调节关系,然后利用实验室已经SIRT2稳定过表达或沉默的细胞系B104来分析SIRT2对Hsp90及其下游炎症因子的调控作用。首先是检测SIRT2对Hsp90蛋白乙酰化水平的影响;其次是检测SIRT2对Hsp90与糖皮质激素受体(glucocorticoid reccptor,GR)之间相互作用的影响;接着进一步检测SIRT2过表达对GR亚细胞定位的影响及其转录活性的影响;最后通过一系列的实验检测SIRT2对Hsp90下游炎性因子表达水平的调控,来进一步分析其作用的细胞生物学功能。方法:首先,我们利用GST-pulldown实验和Co-IP实验来进一步验证SIRT2和热休克蛋白Hsp90之间的相互作用。再通过对已经筛选稳定的SIRT2过表达或沉默的细胞系进行细胞的复苏和培养,然后收细胞提取蛋白质,并进行Co-IP实验以检查SIRT2与Hsp90蛋白质是否结合在一起。接着利用Co-IP实验检测了SIRT2对Hsp90与糖皮质受体GR之间相互作用的影响。然后通过核质分离实验检测SIRT2过表达对GR亚细胞定位的影响。与此同时,利用荧光素酶报告基因实验来检测SIRT2过表达对糖皮质激素受体GR转录活性的影响。最后,我们分别通过qPCR和Western blot技术检测SIRT2对Hsp90下游炎性因子在mRNA水平和蛋白水平的影响,通过PCR将Hsp90突变,分别产生模拟乙酰化和无乙酰化突变质粒分别转染Jurkat细胞,然后在确定两种突变体都过表达后,在有或没有脂多糖LPS刺激的情况下,利用Western blot的方法来进一步验证Hsp90K294的乙酰化是否在介导炎性因子的表达中起着重要的作用,分析可能的信号传导途径。结果:1.我们通过GST-pulldown实验和Co-IP实验来进一步验证SIRT2与热休克蛋白Hsp90之间的相互作用,结果发现能够检测到SIRT2与Hsp90结合的条带,并且与没有脂多糖LPS的刺激下相比,在有LPS刺激的B104细胞中,SIRT2和Hsp90之间的结合作用似乎更强些。而且也同样在B104细胞中能够检测到SIRT2与Hsp90结合的条带。2.在研究SIRT2与Hsp90之间的功能关系的Co-IP实验结果显示,虽然在SIRT2过表达和对照组细胞中Hsp90总蛋白水平相当,且SIRT2过表达并未引起Hsp90总蛋白水平的变化,但是SIRT2过表达后Hsp90乙酰化水平呈现降低的趋势。相反,与总的Hsp90表达水平相比,SIRT2沉默的B104细胞中Hsp90乙酰化水平呈现升高的趋势,表明SIRT2对B104细胞中的Hsp90具有去乙酰化作用。3.接着我们利用co-IP的实验方法来检测SIRT2对Hsp90与糖皮质受体GR之间相互作用的影响。我们利用抗Hsp90的抗体进行IP测定,结果发现,与对照组相比,SIRT2过表达的B104细胞中糖皮质激素受体GR与Hsp90的结合量减少。相反,SIRT2沉默的B104细胞中糖皮质激素受体GR与Hsp90的结合量增加。我们利用抗GR的抗体进行IP测定,并且发现与使用Hsp90抗体的IP测量结果是相似的。与具有或不具有脂多糖LPS刺激的对照组相比,过表达SIRT2的B104细胞中GR与Hsp90的结合量减少。相反,SIRT2沉默的B104细胞中糖皮质激素受体GR与Hsp90的结合量增加。更有趣的是我们用抗乙酰化的Hsp90抗体进行测定,SIRT2过表达或沉默的B104细胞中Hsp90与GR的相互作用水平对应于SIRT2过表达或沉默对Hsp90乙酰化水平的影响,这些结果证明SIRT2通过Hsp90的去乙酰化促进GR与Hsp90的解离。4.随后我们又通过核质分离实验发现,在SIRT2过表达的B104细胞中,细胞核中GR的蛋白水平高于细胞质中的水平。相反,在SIRT2沉默的B104细胞中,细胞核中GR的蛋白水平低于细胞质中的蛋白水平。这些结果说明Sitr2过表达改变了细胞核和细胞质GR的比例,表明SIRT2通过Hsp90的去乙酰化,诱导其与GR解离,最终导致GR易位至细胞核。5.我们又通过荧光素酶报告基因实验测定SIRT2对B104细胞中的GR与其糖皮质激素反应元件GRE(Glucocorticoid receptor response elements,GRE)之间结合能力的影响。首先用Western blot验证SIRT2在B104细胞中确实是过表达或沉默了,以进一步的确认了该荧光素酶报告基因测定结果的可靠性。然后在此基础上进行了荧光素酶报告基因的实验,结果显示,与对照细胞相比,SIRT2过表达增强了荧光素酶报告基因的表达。相反,SIRT2沉默减弱了荧光素酶报告基因的表达,表明了SIRT2能够有效的增加GR的转录活性。6.紧接着,我们通过Western检测了6种细胞系中SIRT2以及细胞因子TNFα,IL-1β和IL-6的表达。发现在这6种细胞系中Jurkat细胞能够同时表达SIRT2和上述3种细胞因子。于是我们利用该细胞分别通过qPCR和Western blot的实验方法检测SIRT2对Hsp90下游炎性因子表达水平的影响。结果显示在有或没有脂多糖LPS的刺激下,与对照组相比,不管是在mRNA水平还是在蛋白水平上,SIRT2过表达抑制炎性细胞因子的表达,而SIRT2沉默促进炎性细胞因子的表达。结果还发现,在有脂多糖LPS的刺激下,与SIRT2沉默相比,SIRT2过表达更能够显著的抑制炎性细胞因子的表达。7.最后,我们为了确定Hsp90 K294的乙酰化是否在介导炎性因子的表达中起着重要的作用。我们构建了Hsp90的模拟乙酰化(K294Q)和Hsp90无乙酰化(K294R)的突变体,对Jurkat细胞进行Western分析,结果显示Hsp90的两个突变体均过表达。然后在SIRT2过表达或沉默的Jurkat细胞中过表达这两个突变体,分别用或不用脂多糖LPS处理后进行Western blot检测,结果发现,Hsp90乙酰化模拟突变与使用或不使用LPS刺激的Hsp90无乙酰化突变相比,这3种炎性因子的表达水平增加。并且还发现,与野生型的Hsp90相比,Hsp90模拟乙酰化(K294Q)突变体几乎消除了Jurkat细胞中SIRT2过表达或沉默的影响,更有趣的是,与对照相比,脂多糖LPS的刺激似乎对Hsp90模拟突变体(K294Q)Jurkat细胞中的炎性细胞因子的表达影响更大。这些结果充分证明了SIRT2在炎症反应中的抑制作用。结论:SIRT2与Hsp90在体外和体内都能够结合并通过对Hsp90去乙酰化,促进糖皮质激素受体GR与Hsp90的解离,最终导致GR移位到细胞核中并促进GR与GRE的结合可能抑制炎性细胞因子的表达。