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鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一类急性、高度接触传染性疾病。感染该病毒后,机体免疫系统会受到损伤,主要是损害鸡的中枢性免疫器官即法氏囊,引发机体发生免疫抑制,当预防接种其他疫苗时,机体的的反应灵敏度下降;当有其他疾病侵袭时,机体对疾病的易感性也会明显升高。VP2蛋白是IBDV粒子主要结构蛋白之一,带有IBDV依赖于蛋白质三维立体构象的保护性中和抗原位点,可以诱导保护性中和抗体的产生。VP5蛋白属于IBDV粒子的非结构蛋白,虽然在病毒复制过程中非必需,但是它参与病毒的致病作用,且具有一定的免疫原性。此外,研究发现将哺乳动物IgG Fc片段与一段基因连接后,经过表达系统表达出的重组蛋白被赋予了类似抗体的特性,作为免疫原免疫机体后,促进了巨噬细胞的活化,不仅增强了外源蛋白的血清半衰期,而且提升了机体对外来抗原的捕获效率。就禽类而言,禽源Ig Y与哺乳动物Ig G在结构上具有很大的相似性,但是对于IgY Fc片段功能方面的研究较少。毕赤酵母作为一个标准表达系统,可对外源蛋白进行高效表达,同时具有操作简便、分泌表达、蛋白易纯化、蛋白能够进行正确折叠以及修饰,且能保持表达产物较高水平生物学活性等多种优点。另外,免疫佐剂能够在机体免疫应答过程中发挥有效的免疫调节作用,它能够通过激活机体的免疫系统来增强机体对抗原的适应性,从而使机体免疫应答反应更为高效持久;经过前期对松花粉多糖的不断研究,实验室发现将松花粉多糖(Taishan pinus pollen polysaccharide)作为各类疫苗的免疫调节剂,具有良好的免疫调理作用。本研究通过毕赤酵母表达系统表达VP2-VP5-Fc融合蛋白,同时选用TPPPS作为免疫调节剂,并评估了其对重组VP2-VP5-Fc融合蛋白的免疫调理作用,以期为IBDV亚单位疫苗的研究以及免疫防控提供理论基础和技术支撑。本研究包括以下三部分内容:1.VP2-VP5-Fc真核表达质粒的构建按照Genbank中公布的IBDV VP2、VP5和鸡IgY Fc段的基因序列,分别设计合成三对特异性引物,以RT-PCR技术为基础从vv IBDV GX8/99克隆化细胞毒中分别扩增得到VP2、VP5基因以及鸡的脾脏RNA中扩增得到IgY Fc段基因,使用SOE-PCR技术将分别扩增出来的VP2、VP5和Fc片段连接重组形成VP2-VP5-Fc融合基因。通过PCR扩增出来的VP2-VP5-Fc基因片段被连接到克隆质粒pMD18-T上,经过基因测序鉴定无误后,用EcoR I和Not I限制性内切酶双酶切重组好的克隆质粒以获取酶切后的VP2-VP5-Fc基因片段,同时采用相同的限制性内切酶将pPIC9表达质粒双酶切,然后将以T4连接酶作为媒介将二者连接起来,经基因测序鉴定准确以后,使用Sac I限制性内切酶将重组表达质粒线性化,然后转化到已经制备好的GS115感受态细胞中;从RDB板上筛选出阳性转化子,然后使用PCR进行特异性验证和基因测序鉴定。同时,在本研究中还向毕赤酵GS115感受态细胞中转入pPIC9空质粒作为阴性对比。2.重组蛋白在毕赤酵母的表达及产物分析重组pPIC9-VP2-VP5-Fc以及空质粒毕赤酵母转化子经鉴定正确后,以甲醇作为诱导物诱导蛋白表达。同时还表达了VP2-Fc、VP2蛋白作为对照。在诱导后24、48、72以及96 h时收集表达的上清液,并且通过SDS-PAGE凝胶电泳观察后,再通过Western免疫印迹分析对表达产物做出鉴定。经分析,表达产量在72 h时达到峰值,并在蛋白凝胶层析中分别呈现出一条分子量为25.63、49.35和67.09 kDa的条带,阴性对照孔中没有出现此条带;经观察,该条带与目的蛋白大小相符。在蛋白免疫印迹分析中也显示了与SDS-PAGE分析中大小一致的的条带。表达产物经镍柱纯化后,再次进行SDS-PAGE凝胶电泳观察,分别在凝胶中仅发现一条分子量为25.63、49.35和67.09 kDa的条带。3.松花粉多糖对融合蛋白免疫效果影响的研究按照一定体积配比将所提取的松花粉多糖与重组融合蛋白混合研制成亚单位疫苗。随机将240只SPF鸡分成6组,于10日龄时,分别颈部皮下免疫接种VP2-VP5-Fc+TPPPS、VP2-VP5-Fc、VP2-Fc、VP2、商品化疫苗以及PBS,并且分别于接种以后的第0、7、14、21、28、35、42、49 d,进行心脏采血(每组3只)然后分别通过ELISA检测方法、流式细胞技术以及MTT方法检测各组血清中的免疫指标,主要检测以下几个方面:血清抗体效价、细胞因子(白细胞介素-2、白细胞介素-4、γ-干扰素)水平外周血CD4+与CD8+水平及T淋巴细胞转化率。在免疫3周以后,除对照组以外,随机地从其他各组中选出30只鸡进行动物保护试验,同时连续7d观察鸡群攻毒后的临床表现并做好相关记录,一周后计算攻毒后各组的保护率。结果表明,单纯的VP2-VP5-Fc亚单位疫苗刺激机体产生特异性抗体免疫保护效果要优于其他组,此外,松花粉多糖作为佐剂明显增强了机体的免疫应答水平。本研究为IBDV亚单位疫苗的研制以及松花粉多糖作为免疫调节剂的研究提供了技术依托和理论支撑。