【摘 要】
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背景: 器官移植现在已经成为治疗终末期器官功能衰竭的有效手段,为缓解临床同种供体的不足,异种器官作为最可能的供体来源越来越受到重视。然而,异种器官移植作为远缘移植,其面临的排斥反应较同种移植更为强烈、复杂。目前,异种移植面临的主要障碍是延迟性排斥反应,在这一过程中,由诱生抗体诱导的移植物Ⅱ型血管内皮细胞激活是异种移植物功能丧失的关键。本课题利用RNA 干扰（RNAi）技术特异性的抑制血管内皮细胞中
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背景: 器官移植现在已经成为治疗终末期器官功能衰竭的有效手段,为缓解临床同种供体的不足,异种器官作为最可能的供体来源越来越受到重视。然而,异种器官移植作为远缘移植,其面临的排斥反应较同种移植更为强烈、复杂。目前,异种移植面临的主要障碍是延迟性排斥反应,在这一过程中,由诱生抗体诱导的移植物Ⅱ型血管内皮细胞激活是异种移植物功能丧失的关键。本课题利用RNA 干扰（RNAi）技术特异性的抑制血管内皮细胞中核因子κB（NF-κB）的表达,研究小干扰RNA（siRNA）对异种移植延迟性排斥反应中Ⅱ型血管内皮细胞激活的抑制作用,探讨RNA 干扰技术在异种器官移植中的应用前景。方法: 1.将昆明小鼠（体重20-25g）颈椎脱臼处死,无菌状态下完整取出其胸、腹主动脉,利用植块法在含有20%胎牛血清的DMEM 培养液中进行小鼠动脉血管内皮细胞的原代和传代培养。倒置相差显微镜下观察内皮细胞的形态和生长特性,进行血管内皮细胞中Ⅷ因子相关抗原的检测鉴定。2.设计并体外化学合成小鼠NF-κB p65 的siRNA;同时筛选对小鼠血管内皮细胞（EOMA）有较高转染效率的转染试剂,并进一步优化该转染试剂在转染小鼠NF-κB p65 的siRNA 时的转染条件。3.将EOMA 细胞分为四组:（1）空白对照组（细胞内不加任何干扰因素）;（2）阴性对照组（脂质体不携带siRNA）;（3）NF-κB siRNA 组（细胞转染NF-κB siRNA）;（4）scramble siRNA 组（细胞转染scramble siRNA）。于转染前一天,在24 孔板中接种EOMA 细胞,共12 孔,加入不含抗生素的适量的DMEM 培养液（含10%的FBS）,转染时细胞的汇合度要达到50-70%。分别在转染后的24h、48h、72h 时以及未转染时（0h）用TRIzol 法提取相应各组细胞总RNA,行RT-PCR 测定细胞内NF-κB p65 mRNA 水平;同时提取各组细胞总蛋白,行Western blot 测定各组细胞NF-κB p65 蛋白。
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