电离辐射对男性生殖健康的影响,已受到了广泛关注。睾丸作为对电离辐射高度敏感的器官,在接受一定剂量以上的电离辐射后会出现不同程度的结构和功能损伤,引起精子发生障碍,健康精子数量显著减少,从而形成暂时甚至永久不育[1]。目前普遍认为精原细胞损伤是睾丸接受一定剂量以上射线辐照后生精障碍的重要原因[2],因此,阐明电离辐射所致精原细胞损伤的分子机制,有助于深入理解睾丸辐射损伤的发生机理。前期研究中我们发现了一种特异性表达于小鼠睾丸组织的E3泛素连接酶—RNF146。泛素化是一种广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰方式,不同的E3泛素连接酶能够作用于不同的蛋白底物,催化特定的氨基酸残基被泛素分子标记,进而被蛋白酶体识别,特异性降解[3]。RNF146作为一种DNA损伤反应蛋白,序列高度保守[4]。研究提示,RNF146能够特异性识别结合凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF),促进AIF发生泛素化修饰,进而在胞质中诱导其降解,修复各种因素引起的DNA损伤,抑制细胞的凋亡[5]。我们前期的研究发现RNF146的表达水平与小鼠性腺发育密切相关,在新生小鼠睾丸组织中RNF146表达极低,随着性发育其表达水平迅速升高[4]。组织病理学研究显示睾丸组织中RNF146主要定位于精原细胞和精母细胞中。RN F146在DN A复制非常活跃的睾丸组织中高表达的意义是什么?大剂量X线辐照后睾丸组织中RNF146表达下调对睾丸功能的影响如何?其分子机制是什么?上述问题的回答,有助于我们深入理解RNF146在睾丸辐照损伤进程中的作用和意义。为此,我们进行了下列两部分研究工作:第一部分X射线辐照对小鼠睾丸损伤及RNF146表达的影响目的观察不同剂量X射线辐照对正常小鼠睾丸组织形态和功能以及RNF146表达的影响。方法取成年雄性C57小鼠240只,随机分为6组,每组40只,分别给予0、0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 G y X射线辐照,通过HE染色观察不同剂量X射线辐照后16h、48h及45d小鼠睾丸组织形态变化;Tunel染色评价X射线辐照后16 h及48 h小鼠睾丸生精细胞的凋亡情况;q-PC R实验检测RN F146 16h和48 h m RN A的表达;45d后雄鼠与雌鼠1∶2合笼,根据辐照后雄鼠致正常雌鼠的受孕情况评价辐照对小鼠生育能力的影响。取成年雄性C57小鼠50只,随机分为5组:B la nk,2G y 16 h,2 G y 48 h,4 G y 16 h以及4G y 48 h,每组10只。所有小鼠全部摘取左侧睾丸,-80℃冻存,术毕1周后分别给予0、2、4 Gy X射线辐照,辐照后16h和48h取小鼠右则对应睾丸,Western-blot分析评价X射线辐照对小鼠睾丸组织中RNF146蛋白表达的影响。结果HE染色结果显示,X射线辐照后16h,各组睾丸组织无明显形态学改变;辐照后48h,1Gy组可见胞核深染、固缩及碎裂,2Gy以上剂量组睾丸组织出现生精细胞形态异常,数量减少;45天后2Gy以下辐射剂量睾丸组织组织形态变化不大,2Gy有明显损伤,4Gy睾丸生精小管有严重的空管,管腔皱缩变小。合笼结果提示2Gy及以下辐射损伤对小鼠生育能力无明显影响,4Gy辐照后小鼠生育能力显著降低。Tunel染色提示4Gy射线辐照后睾丸细胞凋亡主要发生于外层的精原细胞及精母细胞。q-PCR、Western-blot实验表明2Gy和4Gy射线辐照后48h RNF146表达水平整体出现下降趋势。结论小鼠在接受2Gy以上剂量的X射线辐照后睾丸组织会出现损伤,且短期内无法修复,4Gy辐照后损伤严重,雄性小鼠绝育率高达96%,射线辐照诱导生精细胞凋亡,同时伴随着RNF146表达下调。第二部分X射线辐照诱导小鼠精原细胞GC1凋亡及凋亡诱导因子AIF核转位目的本实验以GC1小鼠精原细胞为细胞模型,研究X射线辐照所引起的GC1小鼠精原细胞的凋亡及凋亡诱导因子(AIF)细胞定位的变化。方法将对数生长期的精原细胞细胞株GC1,分别接种至培养瓶和培养板中,分别给予0、3、6、9 Gy X射线辐照,通过溴脱氧尿苷(Brd U)掺入实验检测辐射对细胞增殖速率的影响;辐射后48 h,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核凝集情况,免疫荧光细胞化学染色检测证胞质及胞核中AIF蛋白定位的变化,Western blot分析细胞总蛋白、胞质蛋白及核提取物中AIF蛋白的水平、RNF146总蛋白的变化以及二者表达水平的相关性;通过慢病毒过表达GC1细胞中的RNF146,给予9Gy射线辐照,Western blot检测验证RNF146对AIF定位的影响。结果随着辐射剂量的增加,GC1细胞增殖速率显著减慢,细胞活性降低。6Gy及9 G y X射线辐照后全细胞提取物中A IF蛋白总量变化不大,但细胞核提取物中AIF显著增多,即AIF出现核转位的现象。RNF146随着射线剂量的增加表达降低,9Gy辐照组最明显。过表达RNF146后,能够抑制AIF的核转位。结论X射线辐照能够诱导小鼠精原细胞发生凋亡,该过程中伴有AIF入核的现象,RNF146能够抑制AIF核转位。