高温是影响植物生长和繁殖的最重要的环境压力之一。由于其固着生长的特性,植物更容易受到温度变动的影响。为应对高温对其产生的威胁,植物进化出了一系列的适应机制。膜联蛋白是一类多功能的蛋白,该蛋白家族的特点在于它们能结合钙离子和带负电荷的脂类。越来越多的证据表明植物膜联蛋白可能具有过氧化物酶的活性,暗示其与植物逆境应答相关,然而,植物膜联蛋白在高温逆境中的作用还未见报道。目前关于植物高温耐性的分子生物学研究已有不少,但极少是以种子为材料进行的,尽管植物种子是具有重要价值的基因材料。曾有研究指出莲种子具有耐受极端高温的能力,为寻找种子适应机制中的新基因/蛋白提供了宝贵的材料。本研究采用比较蛋白质组学的方法以寻找高温胁迫信号通路中的新蛋白,由此在莲种子中鉴定到膜联蛋白,将其命名为NnANN1,并研究了该蛋白在高温逆境以及种子活力中的功能。本研究的主要结果如下:1.为研究莲种子的基础耐热性,用高温处理成熟莲种子,结果约50%种子在90°C处理24h后仍能萌发。为鉴定莲种子中的高温响应蛋白,从未处理的对照种子和90°C处理24h的种子的胚中提取蛋白经双向电泳分离用于比较蛋白质组学研究。10个高温处理后含量上调2倍以上的蛋白得到鉴定,其中大部分为能量代谢相关或逆境相关蛋白。在这些热响应蛋白中,选取被鉴定为膜联蛋白的蛋白点2作进一步研究。2.实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印记(western blot)的结果显示,与未经处理的莲种子相比,经高温处理的种子中NnANN1的表达在mRNA水平和蛋白水平都有大幅提高,证实与上述蛋白质组学的结果一致,NnANN1是热响应蛋白。亚细胞定位分析发现NnANN1表现出典型的细胞质定位模式,qRT-PCR分析发现NnANN1主要在种子发育和萌发过程中大量表达,暗示该蛋白可能在种子发育和萌发中发挥作用。3.为证实NnANN1在体内的保护作用,在大肠杆菌细胞和植物种子中进行了功能研究。结果表明,与对照相比,在高温逆境下,NnANN1转化的大肠杆菌细胞和拟南芥的种子耐热性提高。此外,加速老化实验表明NnANN1的表达提高了转基因拟南芥种子的活力。相反,与野生型种子相比,拟南芥同源基因AtANN1、AtANN2的T-DNA插入突变株的种子对于高温逆境和加速老化处理表现得更为敏感。NnANN1转基因种子中观察到过氧化物酶活性提高,并伴随活性氧(ROS)释放水平的降低,这可能帮助阐释NnANN1在体内的保护功能。综上所述,本研究实验结果表明NnANN1在耐热性和种子活力中发挥着重要功能,支持NnANN1在清除ROS中的作用,为研究植物高温应答的分子机制,提高作物耐热性和种子活力开拓了新的可能性。