论文部分内容阅读
微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,在自然界已发现的微孢子虫有150个属,约1400个种,是经济昆虫、鱼类、皮毛动物、灵长类的常见病原。目前发现的微孢子虫中至少5个属13个种能感染家蚕,8个属14个种与人类疾病有关。微孢子虫隶属原生动物界(Protisia)、微孢子虫门(Microspora)、微孢子虫纲(Microsporea)、微孢子虫目(Microsporida)。但近期研究将微孢子虫归属于真菌界,并与鞭毛真菌亚门的内寄生壶菌(Rozella allomycis)的进化关系比较紧密。由于微孢子虫与人类的免疫抑制疾病有关以及它的倍受科学界争议的进化地位,日益引起学者们的关注。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)主要寄生于家蚕,由其引发的微粒子病,是家蚕的毁灭性病害。由于其能经卵传播而被列为蚕丝生产国的唯一检疫对象。大部分微孢子虫有一定的寄主专一性,但也有寄主域较广的微孢子虫。家蚕微孢子虫除寄生于家蚕外,还可以寄生于其他40余种昆虫。微孢子虫的变异不仅表现在形态上的变化,而且在分子水平上也有差异,据最近的基因组学研究发现,即使同一个区域内的家蚕微孢子,也表现出基因组的异质性,具有丰富的多样性的特点。家蚕微孢子虫CQ1原始分离株保藏于中国兽医微生物菌种保藏管理中心,是上世纪80年代由两南农业大学蚕病研究室从重庆北碚地区病蚕体内分离。本研究在建立了家蚕微孢子虫侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)和家蚕卵巢细胞(BmN-SWU)体系的基础上,采取感染家蚕微孢子虫的丝腺单病斑分离出微孢子虫接种细胞,并在细胞中进行传代培养,在Sf21细胞中传代培养到第八代,用此方法纯化家蚕微孢子虫,以期得到遗传背景清楚的家蚕微孢子虫CQ1株系;并通过对家蚕微孢子虫CQ1株系rDNA-ITS进行分析,并结合GenBank中Nosema属微孢子虫的同源序列,构建rDNA-ITS系统树,对家蚕微孢子虫CQ1株系的纯粹性进行了分子评价。1、家蚕微孢子虫侵染草地贪夜蛾卵巢细胞和家蚕卵巢细胞体系的建立草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)贝有生长速度快、易培养等优点,我们在诸多的研究基础上,利用草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)建立家蚕微孢子体外感染增殖体系,同时对孢子在细胞系中的增殖进行了观察。同时利用家蚕卵巢细胞(BmN)建立家蚕微孢子体外感染增殖体系。故本研究选择利用了Sf21细胞系和BmN细胞系建立了家蚕微孢子虫的感染增殖体系,为家蚕微孢子虫功能基因组研究提供了一个补充体系,也为获得未污染的实验材料(N.b)提供了新的途径。从观察到的现象可见,家蚕微孢子虫在寄主细胞中的发育是一个渐进过程,最终将占据寄主细胞质的空间,感染细胞的家蚕微孢子虫先于细胞内周质周缘繁殖,后向中间扩展,最后孢子布满整个细胞质空间。随着时间的增加,寄主细胞终破裂,释放孢子。此外,在孢子繁殖后期,大量孢子从细胞内逸出后,有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。2、家蚕丝腺单病斑微孢子虫接种昆虫细胞及其传代培养采用家蚕丝腺单病斑的微孢子虫接种草地贪夜蛾卵巢细胞和家蚕卵巢细胞,对单病斑的微孢子虫在细胞中的感染增殖进行定期观察,并把增殖的家蚕微孢子虫在细胞中进行传代培养,在草地贪夜蛾卵巢细胞中传代培养八代,在家蚕卵巢细胞中传代培养六代,以期得到纯粹性好的的家蚕微孢子虫株系,并对细胞传代培养后的家蚕微孢子虫的形态与家蚕微孢子虫CQ1分离株进行比较。3、家蚕微孢子虫CQ1株纯粹性的分子评价对所获得家蚕微孢子虫株的纯粹性进行分子评价。通过克隆所获得家蚕微孢子虫株的rDNA内转录间隔区(rDNA-ITS),并分析其序列多态性,从而对家蚕微孢子虫CQ1株的纯粹性进行分子评价。利用特异引物进行聚合酶链式反应以扩增家蚕微孢子虫CQ1株rDNA-ITS区,经PCR反应扩增出长503～516 bp的家蚕微孢子虫rDNA-ITS基因序列。完成了rDNA-ITS 12个克隆测序,rDNA-ITS1与GenBank中序列号为AY259631的家蚕微孢子虫序列相似性为98%;另外其它克隆序列与GenBank中的家蚕微孢子虫序列相似性为88%～96%之间。序列比对发现家蚕微孢子虫rDNA-1TS基因存在着单核苷酸的转换和颠换,以及插入和缺失,并且差异位点大多位于ITS区域内。研究结果表明,从ITS序列分析来看,所建立的家蚕微孢子虫CQ1株系的种内遗传分化比较明显,各克隆存在序列多态性,究其原因,可能由于我们的纯化工作还不够,也可能ITS序列不适合作为评价家蚕微孢子虫纯粹性的分子标记。因为我们发现在基因组内rDNA单元是多拷贝的,小亚基、大亚基和5S rDNA的拷贝数分别为43、53、36。并且发现家蚕微孢子虫的所有染色体上都有rDNA的分布。并且各拷贝间的ITS序列有一定多态性,也就是说,就一个孢子而言,其拥有多个不同ITS序列,这可能我们在分析CQ1株系中ITS序列的多态性仍十分明显的原因。我们将选择更合适遗传标记对CQ1株的纯粹性进行评估。