家蚕属于完全变态昆虫，经过卵、幼虫、蛹和成虫四大形态和机能完全不同的发育阶段，必然有大量凋亡基因参与家蚕发育变态。目前，细胞凋亡的研究对象主要集中在人类、小鼠、线虫和果蝇等模式生物中。家蚕作为重要的经济昆虫，其凋亡相关研究尚处于起步阶段。自1994年成功克隆鼠核酸内切酶FEN-1(flap endonuclease-1)以来，学者们对鼠、人、线虫、酵母等物种的FEN-1基因的功能和结构进行了一系列的深入研究，普遍认为：正常情况下，FEN-1参与DNA的复制和修复，维持基因组的稳定性和DAN复制的精确性。但是FEN-1对细胞凋亡、癌症形成也有重要作用。关于FEN-1怎样使基因组从稳定到破坏的分子机制是一项非常有趣的研究。本研究以家蚕胚胎细胞BmE-SWU1为实验材料，克隆了家蚕FEN-1基因，初步研究了该基因的功能，获得了以下研究结果： 1、BmFEN-1基因的克隆与信息分析 利用家蚕EST数据，根据拼接结果设计引物，成功克隆了家蚕BmFEN-1基因。该基因cDNA长为1343 bp，ORF长1143 bp(ORF：123-1266)，编码380个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为42.7kDa和8.98。将BmFEN-1的cDNA与家蚕基因组序列进行比对，发现该基因具有8个外显子和7个内含子，外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。用在线SMART程序进行结构域分析，发现BmFEN-1基因具有典型的XPG结构域，其中在第95-105氨基酸处是FEN-1的N端核心保守区，第337-344氨基酸处是FEN-1与PCNA蛋白质相互作用区，表明这些位点在家蚕FEN-1基因中仍旧是保守的。通过NCBI的Blast程序进行在线蛋白质序列比对分析表明，BmFEN-1编码的蛋白质序列与人、老鼠、果蝇和伊蚊的蛋白序列相似性较高，分别为61％、63％、7296和74％。 2、UVB诱导家蚕BmE-SWU1细胞凋亡 UVB诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1不同时间后，用四氮唑盐法(MTT)和Hoechst染色及DNA-Ladder法分别检查BmE-SWU1细胞的增殖活性和凋亡情况。结果表明UVB处理家蚕BmE-SWU1细胞后，细胞增殖活性随着照射剂量的增加而逐渐降低；光镜下可见细胞膜表面突出或形成小泡，细胞破裂成凋亡小体。UVB处理24h后，细胞几乎全部破裂成凋亡小体。经Hoechst染色后，凋亡小体在荧光显微镜下清晰可见，细胞DNA电泳条带呈梯形分布，这是凋亡细胞典型的生化特征。 3、BmFEN-1基因功能的初步研究 利用RANi技术，通过转染试剂介导dsRNA(BmFEN-1)，转染家蚕胚胎细胞(BmE-SWU1)，转染后正常培养48h，用以下三种方法进行检查。MTT检查显示干涉组的胚胎细胞的增殖受到明显抑制，存活率为对照组的80％。PI染色后，经流式细胞仪检查细胞周期，干涉组S期细胞数占5.04％，G2/M期细胞数为25.48％，而对照组S期、G2/M期细胞数分别为23.73％和13.09％，表明dsRNA转染能下调BmFEN-1基因表达，导致细胞周期阻滞于S期。TUNEL染色后，经流式细胞仪检查凋亡情况，结果显示：干涉组凋亡率为35.03％，远高于对照组0.99％的凋亡率。经荧光定量PCR检测BmFEN-1基因的表达，扩增结果表明，转染组的基因表达量明显降低，仅为对照组的5％。综上所述，dsRNA(BmFEN-1)转染组的胚胎细胞中BmFEN-1的表达量明显降低，将会抑制家蚕胚胎细胞系的增殖，导致细胞阻滞于S期，并出现明显的凋亡。