论文部分内容阅读
第一部分 Anti-EGFR-PEG-SPIO靶向纳米分子探针的制备以及对肺腺癌细胞（H460）的体外靶向MR成像目的:分析anti-EGFR-PEG-SPIO靶向纳米分子探针的合成、表征及修饰的理化性质,检测其对表皮生长因子受体（EGFR）高表达肺腺癌细胞及荷肺腺癌裸大鼠的靶向性及MRI成像的可行性。方法:（1）首先制备anti-EGFR靶向纳米分子探针（anti-EGFR-PEG-SPIO）及非靶向纳米分子探针（PEG-SPIO）,并行探针理化性质及细胞毒性试验。（2）体外MRI细胞成像:将靶向anti-EGFR-PEG-SPIO及非靶向PEG-SPIO分别与H460细胞孵育2h后,进行体外MR成像,观察其T2WI信号强度的变化。（3）活体MRI成像研究:将3-4周龄无特定病原体（SPF）级裸大鼠右后大腿肌肉内接种人肺腺癌细胞,生长至直径约0.8 cm作为动物模型;将12只裸小鼠荷人肺腺癌肿瘤模型采用完全随机法分成靶向实验组（n=6）与非靶向对照组（n=6）。两组通过尾静脉分别注射 1 mL（40 μg/mL）anti-EGFR-PEG-SPIO 和 PEG-SPIO纳米分子探针溶液。在注射后不同时间点（0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,10和12 h）进行MRI扫描。测量各时间点瘤体大小及肌肉信号强度值,并计算各时间点的信噪比。并行H460细胞及肿瘤组织普鲁士蓝染色及电镜成像观察细胞摄取铁含量数量。结果:自行合成的anti-EGFR靶向纳米分子探针（anti-EGFR-PEG-SPIO）形态规则、分布均匀,具有很强的超顺磁效应,MTT细胞毒性检测及镜下细胞形态学显示出anti-EGFR靶向纳米探针具备良好的水溶性和安全性。不同铁浓度anti-EGFR-PEG-SPIO及PEG-SPIO纳米分子探针分别与H460细胞孵育后,靶向组结果显示H460细胞的信号强度随着铁浓度的升高而明显减低,非靶向组显示H460细胞信号强度减低相对不明显,具有明显统计学差异（p<0.05）。实验组和对照组瘤体的信噪比值具有统计学意义（F=89.02,P<0.01）,实验组不同时间点信噪比值具有统计学差异（F=31.18,P<0.01）,对照组不同时间点信噪比值具有统计学差异（F=4.32,P<0.01）。实验组瘤体强化峰值出现在4-6h时间点,对照组瘤体强化峰值出现在0.5-2 h时间点。普鲁士蓝染色及电镜结果显示靶向组H460细胞内及肿瘤组织内可见大量铁颗粒沉积,而非靶向组仅见少许铁颗粒沉积。结论:自行构建的anti-EGFR-PEG-SPIO纳米分子探针具有良好的水溶性、稳定性及低毒性。体外实验显示对H460肺腺癌细胞具有良好的靶向效应,MRI成像可进行离体标记细胞及载体肿瘤动态监测。体内实验显示anti-EGFR修饰的靶向纳米分子探针对EGFR阳性表达的肿瘤细胞具有靶向性效应,合成的靶向分子探针可作为磁共振T2成像靶向分子探针并实现对体内移植瘤模型的MR分子成像。第二部分 靶向Anti-EGFR-PEG-SPIO纳米分子探针在磁共振引导超声聚焦刀（MRgFUS）对荷肺腺癌裸大鼠肿瘤模型消融的增敏作用的研究目的:探讨anti-EGFR-PEG-SPIO靶向纳米分子探针对磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）成像引导高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound,HIFU）体内消融荷肺腺癌裸大鼠肿瘤模型的协同增敏作用的有效性并减少周围正常组织损伤的可行性。方法:随机挑选24只荷瘤裸大鼠,并随机分为4个实验组:高能量对照组（76 W,n=6）;低能量组对照组（54 W,n=6）;靶向实验组 anti-EGFR-PEG-SPIO（32 W,n=6）;PEG-SPIO非靶向组（54 W,n=6）。动物模型肿瘤直径达0.8 cm时,在MRI实时监测下分别对四组荷瘤裸大鼠后大腿肌肉内移植瘤进行上述不同能级的消融治疗,肿瘤消融时间约23-24 s,在治疗过程中MR实时监测肿瘤的治疗温度,观察治疗温度的变化。治疗前、后均采用TWI、T2WI及DWI序列扫描,后经尾静脉注射钆喷酸葡胺注射液,观察肿瘤强化程度及消融效果。结果:在磁共振引导超声刀（MRgFUS）消融治疗过程中anti-EGFR-PEG-SPIO靶向组及非靶向组的治疗能量（分别为32 W,54 W）均低于对照组（76 W）,两者比较具有统计学差异（P<0.01）;anti-EGFR-PEG-SPIO靶向组的治疗能量（32 W）,低于PEG-SPIO非靶向组（54 W）,两组比较具有显著统计学差异（P<0.01）;四组治疗时间约为23～24 s,四组间比较无显著统计学差异（p>0.05）靶向组、非靶向组及对照组（高能量组）MRgFUS治疗过程中有效治疗温度约为72～74℃,三组间比较无显著统计学差异（P>0.05）,而对照组（低能量组）有效治疗温度显著低于其他三组,具有显著统计学差异（p<0.05）。治疗后T1WI增强显示,靶向组、非靶向组及对照组（高能量组）肿瘤组织中心消融区见低信号未强化区,而低能量组肿瘤组织仍明显强化,消融效果欠佳。大体标本靶向组、非靶向组及对照组（高能量组）显示肿瘤中心呈明显坏死改变,TUNEL细胞凋亡染色见大量凋亡的褐色颗粒染色;而对照组（低能量组）肿瘤中心未见明显坏死,凋亡染色未见明显褐色颗粒染色。结论:应用anti-EGFR-PEG-SPIO靶向纳米分子探针在磁共振引导超声聚焦刀对荷肺腺癌裸大鼠移植瘤模型中具有靶向增敏及协同消融治疗作用,采用较低治疗能量时对肿瘤组织可达到相同消融效果,最大程度减少对周围组织的损伤。第三部分 磁共振功能成像新技术对MRgFUS消融荷肺腺癌裸大鼠后疗效的监测及评估价值目的:探讨磁共振常规扫描及功能成像新技术（DWI、DCE-MRI）对MRgFUS消融治疗荷瘤裸大鼠后疗效评估的价值。方法:对四组消融治疗后的荷瘤裸大鼠在不同时间点（0.5 h,1,3,7,14,30 d）进行T2WI、DWI成像并测量肿瘤中心及周边的T2WI信号值及ADC值,同时行T1WI动态增强扫描,并计算转移常数（Ktrans）,速率常数（Kep）和容积比（Ve）的值,并与EGFR表达（%）值进行相关分析。同时在不同时间点测量肿瘤大小,综合评估肿瘤消融前后的改变。结果:治疗后0.5 h,靶向组、非靶向组及对照组（高能量）肿瘤中心区域ADC值明显减低,随着时间延长至30 d,ADC值逐渐升高,肿瘤周围ADC值改变不明显。肿瘤中心T2WI信号强度随着时间延长逐渐升高,而周围变化不显著。而对照组（低能量）肿瘤治疗前后不同时间点T2WI信号强度及ADC值较治疗前轻度升高,无显著统计学差异（p>0.05）。DCE-MRI结果显示,靶向组、非靶向组及对照组（高能量）肿瘤消融中心未见明显强化（乏血供区）,而肿瘤边缘部分强化明显（富血供区）,对照组（低能量）动态增强后肿瘤组织强化明显,中心消融区域未见明显坏死及强化。相关分析结果显示四组间的Ktrans与肿瘤EGFR（%）表达相关分析结果显示呈正相关（r=0.906,P<0.01）;Kep与肿瘤的EGFR（%）表达呈正相关（r=0.925,P<0.01）,Ve与肿瘤EGFR（%）表达呈负相关（r=-0.848,P<0.01）。结论:应用T2WI、DWI及DCE-MRI序列能够较好的反映肿瘤治疗后的大小变化、肿瘤血供以及肿瘤残存情况,利用MRI新技术可准确反映MRgFUS消融肿瘤的效果。