论文部分内容阅读
目的肝细胞癌是世界第六大常见的恶性肿瘤,在肿瘤中的致死率位居第三。早期诊断并得到早期治疗,是提高患者五年生存率和生活质量的有效手段。目前,我国常用甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白异质体（AFP-L3）两种血清型肿瘤标志物检测肝细胞癌。AFP的灵敏度和特异度不足,临床上40%左右肝细胞癌患者AFP水平并不升高,而在慢性肝炎、肝硬化等肝脏慢性疾病中会有不同程度的升高。AFP-L3是AFP的一个亚型,属岩藻糖基化蛋白,主要由癌变的肝脏细胞产生。AFP-L3不仅可以用于HCC的早期诊断和鉴别诊断,还可以用于疗效评估及复发监测。除AFP-L3外,研究发现其他岩藻糖基化蛋白在疾病的发生、发展过程中起重要作用,这类糖蛋白分子也是肝癌等疾病的潜在候选标志物。本研究拟建立一种基于凝集素亲和的酶联免疫吸附试验用以直接检测岩藻糖基化蛋白,可为我们后期实验应用糖亲和液态芯片检测岩藻糖基化蛋白奠定基础,也可为肝癌等疾病的多种岩藻糖基化蛋白类生物标志物的同时检测提供一种新的检测方法。我们选择AFP-L3作为测定的靶蛋白,因为AFP-L3是目前唯一运用于临床的岩藻糖基化的肿瘤标志物,方便与现有检测技术进行对比。方法1.利用NaIO4温和氧化法去除用于包被的AFP单克隆抗体Fc段上的岩藻糖基。2.采用AFP的单克隆抗体作为包被抗体,生物素标记的凝集素识别AFP-L3上的岩藻糖基,利用链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶（SA-HRP）进行检测。3.对所建立的凝集素亲和的酶联免疫吸附试验各步骤反应条件进行优化,并进行最低检测限,批间、批内精密度,干扰实验,稳定性等性能评价。结果1.抗体温和氧化并封闭氧化生成的醛基最适处理条件为:25mmol/L NaIO4溶于醋酸钠（PH4.5）,4℃避光1.5h;1mmol/L MPBH在18-22℃下避光孵育2h;1mmol/L Cys-Gly溶液,4℃避光孵育12h。2.凝集素亲和的酶联免疫吸附试验最适反应条件:1:800稀释包被抗体,1:8000稀释生物素标记的凝集素和SA-HRP;包被条件是37℃孵育3h;封闭液和封闭条件是Carbo-free Blocking Solution室温下30min;样品37℃孵育2h;生物素标记的凝集素和SA-HRP均为37℃反应30min;显色底物TMB在37℃下避光反应20min。3.方法学的性能评价结果:最低检测限的吸光度值为0.1247,其对应浓度为18.23ng/ml;高值样品的批内和批间精密度分别为5.45%和6.47%,低值样品的批内和批间精密度分别为7.24%和9.37%;实验结果几乎不受胆红素C、胆红素F、溶血血红蛋白和乳糜的影响;不稳定程度随着存放时间的延长而增加,存放2周后进行检测,其差异具有统计学意义（P<0.05）。该方法检测临床样品所得结果与临床检测结果相符。结论1.建立了去除抗体上岩藻糖基的有效方法。2.初步建立了基于凝集素亲和的酶联免疫吸附试验的方法检测AFP-L3,并进行方法学评价证实其可行性。3.对临床样本进行检测,与临床检测结果相符,证实新方法具有临床应用前景。