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本实验室前期利用Ciphergen公司SELDI-TOF-MS(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术结合固相表面层析蛋白芯片对多种肿瘤(包括内胚层来源的结直肠癌[1,2,20,21]、胃癌[3]、肝癌[4]、食管癌[5]和肺癌[6],以及乳腺癌[7]、卵巢癌[8]等)进行血清比较蛋白质组学研究,发现了特异的在这些肿瘤中高表达的标志物,获得了较为理想的结果。但由于SELDI-TOF不具备二级质谱而且分辨率不足以完成PMF(肽指纹图谱,peptide mass fingerprinting,PMF),所以无法鉴定前期研究所发现的标志物,无从获知其序列信息,无法对其功能进行深入的研究。本研究正是基于前期研究所积累的大量血清样本,采用MALDI-TOF/TOF-MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS)串联质谱技术结合液相层析技术(IMAC磁珠,Immobilized Metal ion Affinity Chromatography magnetic bead)对结直肠癌血清进行比较蛋白质组学研究。自本实验保存的结直肠癌术前患者和正常人血清样品库中,随机抽取结直肠癌患者和正常人各30例作为实验组和对照组,其中男女比例为1:1,年龄范围40-60岁,中位年龄53和51岁。其中结直肠癌术前患者均经病理诊断确诊,其中Dukes A期1例,Dukes B、C和D共29例。实验组和对照组有相似的暴露史,均排除影响血清蛋白质含量的其他相关性疾病。随机抽取结直肠癌患者和正常人各50例作为双盲检测组,用于结直肠癌标志物的验证。本研究采用多种生物统计学方法(遗传算法Genetic Algorithm(GA)、快速分类法Quick Classifier、支持向量机算法Support Vector Machine(SVM)、监督神经网络算法Supervised Neural Network algorithm(SNN))对MALDI-TOF/TOF-MS所获取的数据进行分析,结果发现46个蛋白质/多肽在结直肠癌患者血清表达水平与正常人血清中的含量差异有统计学显著差异(P<0.05)。同时用双盲检测对比多种算法建立的诊断模板,发现采用监督神经网络算法建立的模板为最优模板。此算法采用的多肽数据较少,分组总准确率为100%,双盲检测总准确率为100%,特异性为灵敏度均为100%。并根据权重打分,确定1466.9Da在监督神经网络模板中诊断价值最高。与前期SELDI-TOF-MS结合IMAC芯片对结直肠癌血清进行比较蛋白质组学的研究结果,发现并未见相同的模板。为评价其诊断结肠癌的价值,对其作接收者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),ROC曲线下面积为1,说明其诊断结直肠癌的价值极高,并且1466.9Da多肽在结直肠癌血清中高表达,因此被本实验命名为结直肠癌特征多肽(Colorectal CancerCharacteristic Peptide,CCCP)。本研究采用MALDI-TOF/TOF-MS获取结直肠癌特征多肽的二级质谱图,在搜索MASCOT数据库无解的情况下,采用DeNoVo分析,依据多肽碎裂产生离子碎片的规律,推断出结直肠癌特征多肽的氨基酸序列。随后并用BlastP软件搜索GeneBank上的非冗余蛋白质序列数据库,发现结直肠癌特征多肽位于人第20号染色体长臂上,是活性氧调节因子1(reactive oxygen species modulator 1,ROMO1)中的一段序列(第42-53位氨基酸)。活性氧调节因子1分子量与本实验室前期利用SELDI结合IMAC芯片技术发现的结直肠癌生物标志物一样,均为8.9kD,但由于其氨基酸序列不明,所以二者是否存在关联尚不清楚。本研究所发现的结直肠癌特征多肽为ROMO1中一段序列,可能为ROMO1的代谢产物,也可能是ROMO1 mRNA选择性剪切的结果而可能具有相应的功能。同时发现结直肠癌特征多肽在多个物种(物种跨度较大)中均有相同的序列存在,具有高度的进化保守性。而进化的高度保守性提示结直肠癌特征多肽可能在机体的生理或病理生理过程中发挥重要的功能。生物信息学分析结果显示结直肠癌特征多肽具备跨膜或阳离子抗菌多肽的双亲特性,而对于跨膜多肽其功能较为复杂不易于研究。而同时已知有研究[40,41]发现α-defensin-1、2、3(人类中性粒细胞肽(HNP)1、2、3),相对于正常对照样本,其不仅在结直肠癌组织中表达量增高,而且在结直肠癌血清中表达量增高。因此推断结直肠癌特征多肽不仅为诊断结直肠癌的生物标志物,还可能具有抗菌活性。为明确结直肠癌特征多肽的抑/杀菌作用,我们对结直肠癌特征多肽的抑/杀实验室工程菌作用进行量化的评价。并对结直肠癌特征多肽的抗菌谱进行初步研究,发现不仅对革兰阳性菌和革兰阴性菌有效,而且更为有意义的是对耐药菌株有效。明确结直肠癌特征多肽的抗菌功能后,为探索其可能的体外抗菌作用机制,本研究将多肽与pTAT-EGFP BL-21大肠杆菌共孵育后,离心后沉淀细菌重悬后用流式细胞术(FCM)计细菌PI着染比例(PI掺入率),上清用免疫印迹Western Blot方法检测靶细菌是否有绿色荧光蛋白(GFP)的漏出,两种方法共同检测细菌膜的完整性。两种方法所得结果一致提示:结直肠癌特征多肽作用于细菌的细胞壁和/或细胞膜,通过破坏膜的完整性并进而导致靶细菌胞质内容物外泄而发挥抗菌作用。最后本研究对结直肠癌特征多肽的毒副作用(溶血作用)进行了初步研究。将多肽与人红细胞共孵育后,在570nm(D570)处测定光密度值,进而评价其对红细胞膜的破坏作用。结果表明其无体外溶血作用。上述研究表明:1.对比多种建模方法,确立监督神经网络算法建立的模板为最优模板;2.发现在结直肠癌血清中高表达且诊断结直肠癌灵敏度和特异性均为100%的结直肠癌特征多肽,3.对结直肠癌特征多肽的MALDI-TOF/TOF-MS二级质谱图进行DeNoVo分析,确定其氨基酸序列;4.用BlastP软件搜索GeneBank上的非冗余蛋白质序列数据库,发现结直肠癌特征多肽存在于多个物种中,具有进化的高度保守性,同时未见有其功能的相关研究报道,提示其在机体的生理或病理生理过程中发挥重要的功能;5.生物信息学分析结果显示结直肠癌特征多肽具备跨膜或阳离子抗菌多肽的双亲特性;6.结直肠癌特征多肽具有明确的抗菌活性,且需达到一定的浓度才能实现;7.结直肠癌特征多肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌效果,且对AMPR细菌也有效;8.结直肠癌特征多肽可能作用于细菌的细胞壁和/或细菌膜,通过破坏膜的完整性而发挥抗菌作用;9.结直肠癌特征多肽无体外溶血作用。