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目的:顺铂（cis-diaminedichloroplatin,CDDP）是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治疗过程中使用最广泛的一种化疗药物,既往研究认为CDDP的抗肿瘤作用机制主要是诱导肿瘤细胞发生凋亡,然而顺铂治疗后常常会引起肿瘤细胞的凋亡性耐受,影响治疗效果。因此,探索顺铂新的抗癌作用机制,增强顺铂药物作用敏感性将具有一定的临床应用意义。细胞焦亡属于最近新探索出的一种反应更快更剧烈的细胞程序性死亡,常会引起细胞膜打孔,细胞肿胀直至破裂死亡。Gasdermin-E（GSDME）作为抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞焦亡的执行蛋白,被认为是一种抑癌基因,在癌症治疗中发挥了重要作用。本课题主要研究GSDME介导的细胞焦亡在增强顺铂杀伤非小细胞肺癌敏感性方面所发挥的重要作用。方法:1.NSCLC患者肿瘤组织中GSDME表达及其与临床参数的关系（1）采用微阵列的免疫组化法检测90例NSCLC患者肿瘤组织和癌旁组织中GSDME的表达情况。（2）根据患者临床资料分析肿瘤组织中GSDME表达水平的高低与患者的肿瘤体积、TNM分期、年龄、死亡率、生存期和复发率之间的关系。2.细胞水平探讨GSDME表达水平对CDDP诱导细胞焦亡的影响（1）Western-blot法检测GSDME在A549和H1299肺癌细胞中的表达情况,观察CDDP作用于细胞后的焦亡变化情况。（2）Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测CDDP对A549和H1299细胞增殖能力的影响。（3）乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）试剂盒检测CDDP作用于A549和H1299细胞后LDH的释放情况。（4）采用慢病毒转染的方法构建GSDME沉默和过表达的NSCLC细胞,Western-blot法检测A549和H1299细胞中GSDME蛋白的抑制和过表达情况。（5）扫描电子显微镜下观察重组慢病毒转染的细胞暴露于CDDP后的形态学变化,并采用Western-blot法检测Caspase-3和GSDME的活化情况,LDH试剂盒检测LDH的释放情况。（6）采用Annexin V-PE/7-AAD双染流式法分析GSDME表达水平高低影响CDDP诱导细胞死亡的情况。CCK-8、细胞克隆形成实验评估GSDME对CDDP抑制细胞增殖能力的影响。3.动物实验探讨GSDME介导的焦亡对CDDP增强抗癌作用的影响（1）在BALB/c裸鼠体内分别构建经过LV-SCR-sh RNA、LV-GSDME-sh RNA、LV-NC和LV-GSDME慢病毒稳定转染的人源性NSCLC细胞移植瘤模型,CDDP治疗10天,每天测量肿瘤体积变化。（2）将分别经过以上四种慢病毒稳定转染的LLC细胞移植于C57BL/6小鼠腹部皮下,使用CDDP治疗14天,每天测量肿瘤体积变化。（3）通过流式细胞术分析移植瘤内免疫细胞的浸润情况,采用高通量液相蛋白芯片技术检测C57BL/6小鼠血液中的趋化因子水平。（4）将经过LV-NC和LV-GSDME慢病毒稳定转染的LLC细胞移植于BALB/c裸鼠腹部皮下,经CDDP治疗10天后,通过流式细胞术分析移植瘤内CD3+T细胞、CD49b+NK细胞、CD11C+树突状细胞和F4/80+巨噬细胞的浸润情况。结果:1.GSDME表达水平与NSCLC患者生存率和生存期呈正相关（1）90例NSCLC患者肿瘤组织中GSDME的表达水平明显低于癌旁组织。（2）GSDME的表达水平与肿瘤体积、TNM分期、年龄和复发率之间无显著性统计学差异（P>0.05）。（3）低表达GSDME的肺癌患者的死亡率明显高于高表达GSDME的患者（P<0.001）。（4）GSDME高表达的NSCLC患者的生存时间明显延长。2.GSDME增强CDDP杀伤NSCLC细胞的敏感性（1）高表达GSDME的A549细胞比低表达GSDME的H1299细胞对CDDP更加敏感。（2）CDDP可以诱导NSCLC细胞发生GSDME途径的细胞焦亡。（3）过表达GSDME可以增强CDDP杀伤癌细胞的敏感性,促进细胞打孔、LDH释放和死亡,抑制细胞的生长和克隆形成。相反,沉默GSDME后,CDDP对细胞的敏感性减弱,细胞孔洞形成和LDH释放减少,抑制细胞的生长和克隆形成的能力减弱。3.GSDME在BALB/c裸鼠移植瘤模型中短暂提高了CDDP治疗的抗肿瘤作用在免疫系统缺陷的BALB/c裸鼠中,GSDME有效的促进了CDDP对A549和H1299移植瘤的敏感性,能短时有效抑制肿瘤的生长,但是CDDP并不能使GSDME高表达的肿瘤持续性消退。4.GSDME介导的细胞因子外流诱导移植瘤中的T细胞浸润（1）在免疫系统正常的C57BL/6荷瘤小鼠体内,经CDDP治疗后可以使GSDME过表达的LLC移植瘤持续性消退,但不能抑制GSDME低表达肿瘤的生长。（2）经CDDP治疗后,GSDME过表达增加了LLC肿瘤中CD3+T细胞的数量,然而,并没有促进CD49b+NK细胞、CD11C+树突状细胞和F4/80+巨噬细胞的免疫浸润。（3）移植有过表达GSDME的LLC肿瘤的C57BL/6小鼠经过CDDP治疗后,血液中的细胞因子的水平明显升高。（4）在BALB/c裸鼠中,CDDP依旧不能使GSDME过表达的LLC移植瘤持续性消退,虽然GSDME过表达的肿瘤中同样增加了CD3+T细胞的浸润,但是BALB/c裸鼠中的T细胞要比C57BL/6小鼠少很多。结论:通过对临床标本的检测及分析,我们发现GSDME在NSCLC患者肿瘤中的表达水平明显低于癌旁组织,并且经铂类药物治疗的患者肿瘤中GSDME的水平与其生存率和生存期成正相关,说明GSDME的表达可能在NSCLC患者对铂类药物的先天敏感性中起关键作用。在细胞水平上,CDDP可激活NSCLC细胞中依赖GSDME的细胞焦亡,并且GSDME的高表达有助于提高CDDP对癌细胞生长抑制以及杀伤效果。通过小鼠异种移植瘤模型实验,我们发现CDDP的抗肿瘤作用与其通过GSDME介导细胞焦亡,释放细胞因子诱导肿瘤免疫细胞浸润有关。