研究背景新生儿窒息是指由于围生期的各种原因使新生儿出生后不能建立正常呼吸,引起缺氧、酸中毒,严重时可导致全身多脏器损害的一种病理生理状况。其本质是缺氧,当造成脑部供血供氧不足时,可表现出如抽搐、意识改变、肌张力异常等症状,称为缺氧缺血性脑病。我国活产婴儿每年1800-2000万,窒息发生率为13.6%,发生不同程度伤残率为15.6%。远期不仅可遗留神经系统后遗症如脑瘫、学习记忆障碍等,还可能出现永久性的内分泌改变如垂体功能减退症。有学者甚至认为垂体功能减退症有50-60%有围产期窒息或臀位产等异常分娩史。垂体功能减退症是指一种或一种以上的垂体激素缺乏,多伴有小垂体,垂体后叶异位或缺如(ectopic posterior pituitary, EPP),垂体柄发育不全(pituitary stalk abnormality, PSA),垂体柄变细中断甚至消失等垂体形态的改变。我们研究发生窒息后脑损伤的垂体激素水平的变化并结合垂体MRI的影像学检查,希望能够早期发现垂体功能减退症的患儿,并给予干预,以防影响生存质量。缺氧缺血性脑病多为继发于窒息造成的损伤,这种全身性缺氧缺血是种强烈的应激刺激,可造成体内多种激素水平发生变化。对于这些激素水平的变化机制及发挥的作用,我们试图通过体外细胞培养以模拟体内的病理状况去研究和解释。对于垂体激素水平的改变是否会造成垂体形态的改变,如垂体体积、垂体前叶信号、垂体高度等,将行垂体MRI检查以阐明。在新生儿领域,关于垂体测量的数据报道较少,我们的数据将有助于积累这方面资料。垂体激素除了熟知的内分泌功能外,还参与免疫调节,神经保护,水电平衡的调节等。我们选择从对神经保护作用方面进一步研究。垂体激素中催乳素(PRL, prolactin)是近20年来受关注较多的激素之一,它是由腺垂体泌乳细胞所分泌的一种蛋白质类激素,与生长激素(GH)、胎盘催乳素(HPL)和增殖蛋白(Proliferin)属同一家族。其结构相似,具有类似的生物学作用,可影响生长发育、生殖内分泌及调节免疫等。催乳素通过与其受体结合,继而激活信号转导通路发挥作用,同时又与其它多种激素和受体的信号转导通路相互作用,产生复杂的生物学效应。本研究拟体外培养大鼠神经元细胞系和原代培养大鼠海马神经元,探讨催乳素调控MAPKs和AKT信号通路对神经元的保护机制。从而加强对催乳素的认识,以期发现缺氧缺血性脑病治疗的分子靶点。第一部分新生儿缺氧缺血性脑病垂体激素变化及其意义目的探讨新生儿缺氧缺血性脑病垂体前叶激素水平变化及其意义。方法1、收集泰安市中心医院自2013-05至2015-05期间住院治疗的80例有窒息史的新生儿缺氧缺血性脑病患儿为观察对象。根据中华医学会于2005年制定的HIE分度标准分为3组,轻度组(n=35)、中度组(n=25)、重度组(n=20);对照组为无窒息史和其他神经系统疾病的新生儿30例。分别于入院6小时,48小时,7天抽取外周静脉血,测定血中下丘脑-垂体-肾上腺轴上的促肾上腺皮质激素释放激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH )、皮质醇(cortisol,COR);下丘脑-垂体-生长激素轴上的生长激素(Growth hormone,GH),胰岛素样生长因子(Insulin growth factor-1, IGF-1)的水平;下丘脑-垂体-甲状腺轴上促甲状腺素(Thyroid-stimulating hormone, TSH),游离三碘甲状腺原氨酸(Free triiodothyronine, FT3),游离甲状腺素(Free thyroxine, FT4)的水平;下丘脑-垂体-性激素轴上卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH),促黄体生成素(Luteinizing hormone,LH),泌乳素(Prolacin,PRL),雌激素(Estradiol,E2),睾酮(Testosterone, T)的水平,对各组间的激素水平进行统计学分析,对不同时间点的激素水平进行动态分析。2、80例病人重度组2例死亡,完成随访78例于3个月时进行Gesell发育量表评估,并根据评估情况分为预后不良组与预后良好组,复查垂体激素水平GH、TSH、LH、FSH、ACTH、PRL,进行两组间的比较。结果80例HIE患儿及30例对照组均计入结果分析。在新生儿出生后3个时间点(6h、48h、7 d)检测到的新生儿血液中垂体激素水平的变化如下1、对生长激素轴的影响对GH的影响:随着HIE程度的加重,3个时间点检测到新生儿血液中GH的水平均先增加后降低,与对照组相比较,差异显著(P<0.015)。对IGF-1的影响:随着HIE程度的加重,6, 48h检测到新生儿血液中IGF-1的浓度均呈下降趋势,与对照组相比较,差异均显著(P<0.05)。至7天,轻中度组恢复至与正常对照无明显差异,重度组未能恢复。2、对甲状腺轴的影响对FT3的影响:随着HIE程度的加重,3个时间点检测到新生儿血液中FT3的浓度呈下降趋势,与对照组相比较,差异均不显著(P<0.05)。对FT4的影响:重度HIE患儿,6, 48h时间点检测到新生儿血液中FT4的浓度均呈下降趋势,与对照组相比较,差异显著(P<0.05)。至7天,轻中度组基本恢复至与正常对照无明显差异,重度组未能恢复。对TSH的影响:新生儿出生后,随着时间的推移,新生儿血液中TSH水平有下降趋势;中重度HIE组在3个时间点检测到新生儿血液中TSH的浓度较对照组、轻度组明显下降,差异显著(P<0.05)。3、对性腺轴的影响对LH的影响:重度HIE组患儿3个时间点均检测到血液中LH的水平明显下降,与对照组相比较,差异显著(P<0.05)。对FSH的影响:重度HIE组患儿3个时间点均检测到FSH水平的下降,与对照组相比较,差异显著(P<0.05)。对PRL的影响:随着HIE程度的加重,3个时间点检测到新生儿血液中PRL的水平均呈上升趋势,与对照组相比较,差异均显著(P<0.05)。对E2、T的影响:新生儿出生后,随着时间的推移,新生儿血液中E2、T的水平有升高趋势;随着HIE程度的增加,3个时间点检测到新生儿血液中E2、T的浓度无明显变化,与对照组相比较,差异均不显著(P>0.05)。4、随访至3个月发现,预后不良组主要来自重度组病人,预后不良组GH、TSH、LH的变化较对照组明显降低,PRL升高。结论1、HIE患儿存在不同程度的垂体前叶激素分泌的紊乱。轻中度患儿多可在1周恢复正常水平。重度HIE早期激素水平改变显著,且恢复较慢。监测激素水平变化有助于了解病情严重程度。2、HIE可引起生长激素轴上GH水平先升高后下降,GH是应激激素。IGF-1水平随缺氧缺血的严重程度而下降,与病情严重程度有相关性。3、HIE可引起性激素轴上的PRL明显升高,HIE程度越高,PRL升高越明显,二者呈正相关。4、HIE可引起甲状腺轴上TSH下降,FT3、FT4下降。5、预后不良组GH、TSH、LH的变化较对照组明显降低,PRL升高。这几种激素对于预后有一定的预测价值。第二部分新生儿缺氧缺血性脑病垂体的MR表现目的研究足月缺氧缺血性脑病新生儿垂体形态、体积、垂体前叶信号强度。方法选取我院2013-05至2015-05收治的符合新生儿缺氧缺血性脑病标准的患儿80例,根据中华医学会于2005年制定的HIE分度标准,分为轻(n=35)、中(n=25)、重度(n=20)三组,同时选取30例对照组,对照组无内分泌疾病,无宫内窘迫史。于生后7-10天行垂体MRI检查。使用德国Siemens Avanto 1.5T磁共振扫描仪行颅脑检查,选择T1WI系列垂体正中矢状位层面,测量垂体高径,腺垂体前后径,垂体前叶信号强度及同层面桥脑橄榄核信号强度比值。在冠状位层面测量垂体冠状宽径和高径,代入公式π/6×(腺垂体前后径X冠状高径×冠状宽径)计算垂体体积。结果其中重度HIE组两例死亡,未完成MRI检查,实验组共78例。1. HIE轻中重度组垂体上缘呈上凸型的分别占88.5%,88%,88.8%,与对照组90%无显著差异。2.垂体体积均值在轻、中、重三组与对照组相比无明显差异。3.垂体前叶信号强度与桥脑橄榄核比值在HIE重度组明显降低,与HIE轻中度组及对照组相比有显著差异(p<0.05)。4.垂体各径线在HIE轻中重度组及对照组无明显差异(P>0.05)。结论1.缺氧缺血性脑病对垂体上缘形态无明显影响。2.轻中度缺氧缺血性脑病对新生儿垂体体积和垂体前叶信号强度无明显影响。3.重度缺氧缺血性脑病可伴有垂体前叶信号的减退。第三部分催乳素(PRL)调控MAPKs和AKT通路对神经元的保护机制目的有文献报道,催乳素在体内可通过调控MAPKs和AKT信号通路治疗大鼠/小鼠脑缺血损伤,促进神经再生和修复,是潜在的神经保护剂,然而其分子机制仍不清楚。本研究拟体外培养大鼠神经元细胞系和原代培养大鼠海马神经元,探讨催乳素调控MAPKs和AKT信号通路对神经元的保护机制。方法体外培养大鼠起源的海马神经元细胞系HT22细胞和大鼠原代海马神经元MTT方法检测催乳素对HT22细胞活性的影响,并评价PRL抑制氧糖剥夺诱导的神经元毒性及机制Western blotting方法检测MAPKs和AKT信号通路蛋白的表达情况结果1. MTT结果表明:催乳素在12.5-800 ng/ml的剂量范围内对HT22细胞活性无显著影响,细胞形貌、细胞数量及细胞之间的连接无显著变化;催乳素体外对原代神经元无显著细胞毒性;催乳素体外可显著促进神经元生长、延长神经元生存。2.催乳素体外可显著抑制氧糖剥夺诱导的神经元毒性,表现为神经元活性的升高;.抑制氧糖剥夺诱导的神经元形貌的改善,表现为轴突的变长、分支变多,延长神经元体外存活时间。3. Western blotting结果表明:催乳素剂量依赖性和时间依赖性激活了 MAPKs通路,表现为90 min内p-ERK的持续激活,对p-p38和p-JNK的磷酸化激活无显著影响;催乳素可显著减弱氧糖剥夺对p-AKT和p-ERK的抑制;其次,催乳素处理HT22细胞,时间依赖性和剂量依赖性诱导了 p-AKT的持续激活;PI3K/AKT抑制剂和MEK/ERK抑制剂的加入,进一步证实了催乳素对MAPKs和AKT信号通路的调控作用。结论1.催乳素对体外神经元细胞无明显细胞毒性;体外可显著抑制氧糖剥夺诱导的神经元毒性。2.催乳素可剂量依赖性和时间依赖性激活MAPKs中p-ERK的表达,对p-JNK和p-p38的表达无显著影响。3.催乳素可剂量依赖性和时间依赖性激活p-AKT的表达。4.催乳素可能是通过调控MAPKs和PI3/K信号通路促进神经元生存,抑制神经元凋亡,进而起到神经保护作用。本实验数据的获得,将为催乳素治疗神经系统疾病的机制提供实验依据。