芋头水溶性多糖提取分离、表征及其对巨噬细胞的影响

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本文以自制的荔浦芋冻干粉为原材料,利用热水浸提法得到了芋头水溶性多糖,对其进行进一步的分离,并研究比较不同芋头水溶性多糖组分的结构特点及其对巨噬细胞的影响。主要研究结果如下:首先考察了提取水溶性多糖的四个重要参数条件,即料液比(1:30)、水提时间(2h)、水提温度(100℃)、醇沉浓度(80%)。通过此工艺得到的芋头粗多糖(TPS)略带粉色,无特殊气味、呈蓬松絮状,其主要成分为多糖(61.34%)、水分(16.35%)、糖醛酸(13.72%)和蛋白质(5.08%)。TPS进一步通过DEAE52-纤维素离子交换柱层析作用,分别用超纯水洗脱得到的中性多糖TPS1和用0.1mol/L的Na Cl溶液洗脱得到的酸性多糖TPS2,其中多糖含量分别提高至87.40%和81.70%。二者分别经Sephadex G-200凝胶柱层析得到单一洗脱峰,TPS2优先TPS1流出;高效凝胶渗透色谱进一步表明TPS1中主要成分的分子量为1.11×104Da,TPS2中含有两种主要大分子,分子量分别为4.90×106Da和6.50×104Da,以上结果表明TPS中至少含有一种中性多糖和两种酸性多糖。然后利用紫外可见光光度计、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、傅里叶变换红外光谱仪、高效液相色谱仪以及原子力显微镜等仪器对TPS1和TPS2成分、特殊官能团、单糖组成、溶液中的构象、支链的情况以及表面形貌等结构特征进行鉴定。TPS1和TPS2均为一类复合糖,由少量蛋白和多糖结合而成,即蛋白聚糖。TPS1当中的多糖为α构型吡喃多糖,主要由D-甘露糖(21.79%)、L-鼠李糖(4.90%)和D-葡萄糖(73.31%)三种单糖组成,具有三螺旋结构,存在较多分支或较长支链,表面形貌较为粗糙(Sa=3.8380nm);TPS2中含有两种主要蛋白聚糖分子,含有β-呋喃多糖,含有糖醛酸和硫酸基团,构成多糖的单糖单位主要为D-甘露糖(7.15%)、L-鼠李糖(25.86%)、D-半乳糖醛酸(56.93%)和D-葡萄糖(10.03%)四种,不具有三螺旋结构,存在较多分支或较长支链,表面相貌相对平坦(Sa=0.2321nm)。最后以巨噬细胞RAW264.7为实验材料进行体外细胞实验,探究了TPS1和TPS2对RAW264.7免疫活性功能的影响,主要采用CCK-8试剂法、中性红吞噬实验、Griess试剂法以及酶联免疫吸附法分别对RAW264.7的增殖活性、吞噬活性、NO分泌能力以及细胞因子(TNF-α、IL-1β)分泌能力进行测定。结果表明:在实验浓度范围内(25-400μg/m L),二者对RAW264.7均无毒副作用并能促进其免疫功能。其中,TPS1在增强巨噬细胞吞噬能力方面表现出更好的调节活性,TPS1能够显著提高该细胞的中性红吞噬能力(P<0.05),吞噬指数最大可达到空白对照组的2.07倍;TPS2在促进巨噬细胞增殖、促进NO分泌、促进TNF-α和IL-1β分泌方面发挥出相较于TPS1更好的促进作用,TPS1和TPS2作用下的NO分泌量可分别提高3倍和4.6倍,TNF-α的分泌量可分别提高3倍和3.7倍,IL-1β的分泌量可分别提高1.4倍和1.6倍。
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