作为革兰氏阴性益生菌的重要成员之一,Escherichia coli Nissle 1917（EcN）已经受到了广泛的研究和应用。但是,包括EcN在内的益生菌在实际应用过程中都存在作用效果缺乏稳定性以及个体差异等问题,这阻碍了 EcN的进一步开发和应用。而解决上述问题的策略之一就是探究EcN的功能性成分及其作用机制。已有的研究表明,EcN能够通过向胞外分泌某些活性成分来介导宿主肠道上皮的一些生理反应,而外膜蛋白（Outer membrane protein,Omp）是其中重要的组成部分。因此,作为一种重要细菌组成成分,外膜蛋白在EcN的益生作用中具体扮演了怎样的角色需要进一步探索。鉴于大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）的外膜蛋白A（OmpA）和外膜蛋白T（OmpT）在介导细菌对上皮细胞屏障作用过程发挥了重要的作用,且EcN有益作用之一即为增强肠道上皮屏障,所以本研究在研究初期选择EcN ompA基因（ompAEcN）和ompT基因（ompTEcN）作为研究靶基因,探究EcN外膜蛋白对肠道屏障的作用及其初步作用机制。本研究首先运用λ-Red同源重组技术构建出EcNΔompA和EcNΔompT缺失株,并同时构建 EcNΔompA/pBR322ompA和EcNΔompT/pBR322ompT回补株。细菌生长曲线实验结果表明,敲除基因ompAEcN和ompTEcN不影响EcN正常生长。然后以人结肠腺癌上皮细胞（Caco-2）作为体外肠道上皮模型,将Caco-2细胞与不同的菌株分别进行共培养处理,包括空白对照组、EcN野生株、EcNΔompA缺失株、EcNΔompT缺失株、EcNΔompA/pBR322ompA 回补株、EcNΔompT/pBR322ompT 回补株和工程菌E.coliDH5α。进一步通过 qRT-PCR 和 Western blot检测与不同菌株共培养后的Caco-2细胞中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1在转录和蛋白水平的差异。结果表明,相比EcN野生株处理组,与EcNΔompA缺失株共培养后的Caco-2细胞中Claudin-1蛋白的表达在转录水平（下降了 61%,P<0.01）和蛋白水平（下降了 52%,P<0.01）显著下降,与空白对照组的水平接近。ompAEcN的缺失对于所有处理组中ZO-1的表达水平没有影响;同时ompTEcN的缺失对Caco-2细胞的Claudin-1和ZO-1表达水平均无影响。以上结果表明,仅OmpAEcN会通过改变Claudin-1表达水平来影响宿主肠道屏障完整性。进一步探究ompA EcN调节Claudin-1表达的机制,我们分别探究了 Caco-2细胞中的OmpA受体（gp96蛋白）在转录和蛋白表达水平上的变化,以及Claudin-1相关细胞因子IL-22、炎性细胞因子IL-6和TNFα在转录水平上的变化。结果显示,相对于EcN野生株处理,EcNΔompA缺失株处理组中gp96蛋白的转录水平（下降了 63%,P<0.01）和蛋白水平（下降了 48%,P<0.01）显著下降;EcNΔompA缺失株处理组中的IL-22的转录平相较于EcN野生株处理也有显著下降,下降了 49%,P<0.01。敲除ompAEcN基因对Caco-2细胞中IL-6和TNFα的转录水平没有影响。以上实验结果显示,OmpAEcN蛋白可以通过激活gp96蛋白,从而提高Claudin-1和IL-22 的表达来增强肠道屏障。为了进一步明确OmpA蛋白的作用,我们将连接有ompAEcN基因的pBR322质粒转化入共生菌E.coliG58-1中,构建出重组菌E.coliG58-1/pBR322ompA。然后通过qRT-PCR实验和Western blot实验检测不同细菌细胞培养处理组（包括空白对照组、EcN野生株处理组、E.coliG58-1野生株处理组和E.coliG58-1/pBR322ompA重组菌处理组）的Caco-2细胞中Claudin-1和gp96蛋白在转录和蛋白水平的变化情况,以及细胞因子IL-22,IL-6和TNFα在转录水平的差异。结果显示,与E.coliG58-1野生株相比,经过E.coliG58-1/pBR322ompA重组能够显著促进Caco-2细胞中Claudin-1、gp96和IL-22的表达水平,并且达到接近EcN野生株处理组的水平。而E.coliG58-1野生株和E.coliG58-1/pBR322ompA处理组之间的IL-6和TNFα转录水平无显著差异。以上结果进一步明确了OmpAEcN的作用及其作用机制。最后,我们进一步在小鼠模型中验证OmpAEcN蛋白的作用。将EcN野生株、E.coliDH5α、EcNΔompA缺失株、EcNΔompA/pBR322ompA回补株、E.coliG58-1野生株以及E.coliG58-1/pBR322ompA重组株通过灌胃接种到小鼠体内。然后检测小鼠肠道中Claudin-1和gp96蛋白在转录和蛋白表达水平的差异以及细胞因子IL-22、IL-6和TNFα在转录水平的差异。结果显示,与EcN野生株处理组相比,灌服EcNΔompA缺失株的小鼠肠道中Claudin-1蛋白在转录（下降了 53%,P<0.01）和蛋白表达（下降了 57%,P<0.01）水平均显著下降;gp96蛋白的mRNA水平（下降了 61%,P<0.01）和蛋白水平（下降了 52%,P<0.01）也显著下降;同时与E.coliG58-1野生株处理组相比,灌服E.coliG58-1/pBR322ompA重组株的小鼠肠道中Claudin-1和gp96蛋白在转录和蛋白水平显著提高--在转录水平分别提高了 88%和81%（P<0.01）以及在蛋白水平分别提高了 106%和102%（P<0.01）,与EcN野生株处理组的水平接近。EcNΔompA缺失株处理组小鼠肠道中IL-22的转录水平与EcN野生株处理组相比下降了 50%（P<0.01）,而E.coliG58-1/pBR322ompA重组株处理组中IL-22的转录水平与E.coliG58-1野生株处理组相比显著提高（提高了 82%,P<0.01）,达到接近EcN野生株的水平。同时小鼠肠道IL-6和TNFα的水平不受OmpAEcN影响。以上结果与体外试验的结果一致。综上,体外和体内实验的结果一致表明,OmpAEcN蛋白可以激活肠道受体gp96蛋白,以增强肠道上皮中Claudin-1和IL-22的表达水平,最终改善宿主肠道屏障。