论文部分内容阅读
鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)能引起鸡及其它禽类的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease, CRD)和火鸡传染性窦炎(Infectious sinusitis),该病广泛分布于世界上所有养禽的国家,且常继发或并发新城疫、传染性支气管炎等其他呼吸道传染病,造成巨大的经济损失。MG感染和寄生最重要的步骤是牢固地黏附在呼吸道黏膜固有层。因此,为了深入研究MG致病机制,本研究对MG主要黏附素GapA的相关免疫特性进行探索,并成功构建MG通用型转座载体和oriC可复制型载体用于MG基因靶向缺失研究。1鸡败血支原体强弱毒株gapA基因的克隆及序列测定本研究通过RT-PCR和PCR扩增MG不同毒力毒株的gapA基因N端序列,测定各基因片段序列,并比较其在转录水平、翻译水平和序列之间的差异性。结果表明:gapA基因存在于一个大型的mRNA转录产物中,与licA、mgc2、crmA三个基因同在一个基因簇中;不同毒株之间,gapA基因N端存在明显的差异,GapA的90～290aa之间即为GapA的高变区(图1-9、图1-10)。而对于Rhigh,常出现在多个位置插入有单一“A”的现象,如:第105位、385位和910位,导致随后的基因序列移码成TAA终止子,致使翻译提前终止;而对于ts-11株,gapA N端的第142nt处由“C”突变为“A”,形成TAA密码子,致使翻译提前终止。而强毒株Rlow、S6、DC9604和弱毒株F、6/85均能编码gapA基因全长,编码大约110～120kD左右的蛋白。这几个毒株之间的区别在于:GapA的N端100~300aa之间存在高变区。这为GapA的表达和抗体制备奠定了基础。2鸡败血支原体Rlow株GapA氨基端(GapAN)的高效表达本研究通过PCR扩增GapA蛋白N端多肽(98~322aa)(GapAN)和C端(882aa-1115aa),分别连入pGEX-6P-1载体,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,结果发现GapAN获得高效表达;而GapA C端未能成功表达。将GapAN亚克隆入pFAST-Bac1载体中,转座DH10Bac细菌,通过转染Sf9细胞,获得GapAN的重组杆状病毒。抗GapAN的多抗利用IFA检测,结果显示:GapAN成功地在杆状病毒中高效表达。3鸡败血支原体GapAN单抗制备利用GapAN的原核表达产物免疫Balb/c小鼠,并利用Bac-to-Bac表达系统表达的GapAN进行筛选,成功制备获得5株抗GapAN特异性单抗(1B5、1D7、3D4、4B3、5B10)。对单抗的免疫特性研究发现:单抗5B10株可以检测强弱毒株表达差异的GapA,表明该毒株极可能针对GapAN的高变区;3D4株出现荧光阳性效价,且其WB反应性最强,虽然不能区分强弱毒株,但该单抗可以用于GapA的常规表达鉴定;其余单抗的反应特异性不强,也在WB反应中出现多个条带。这一研究为GapA的功能研究及缺失筛选研究提供了必要的工具。4通用型转座载体mini-Tn4001tetM构建为了方便黏附素GapA等功能基因的研究工作,本研究根据转座子原理成功构建了MG的通用型转座载体:mini-Tn4001tetM。该转座载体包含有外置的金黄色葡萄球菌转座酶基因(tnp)和IS256重复序列(含Inner和Outer),筛选基因为粪肠球菌Tn916转座子的四环素抗性基因tetM。本研究对筛选基因、启动子进行了改造,置换了lacZ基因和MG tuf启动子等元件。电转化的初步结果显示:该转座载体可以在MG中连续传代。对插入区域和转座的稳定性鉴定工作正在进行中。5鸡败血支原体oriC复制型载体构建根据MG假定的oriC区域,设计不同引物扩增MG不同大小的oriC片段,分为:Long oriC(LoriC)、Short oriC(SoriC)和Whole oriC(WoriC)。分别将片段插入到pBlueScript SK(+)载体中,并插入含有Tn916四环素抗性基因(tetM)中,成功构建MG oriC可复制型载体。本研究将为研究MG功能基因提供必要的手段。