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细胞色素P450 (Cytochrome P450, CYP450)是一个超家族酶系,几乎存在于昆虫的所有组织中,参与外源化合物的代谢、蜕皮激素和保幼激素的合成与降解等过程。本文以飞蝗(Locusta migratoria)为研究对象,克隆获得3个CYP4家族基因,CYP303A1及细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 Reductase, CPR)基因,并对上述CYP450基因的mRNA表达特性和功能进行深入研究,从而为分子靶标的筛选和蝗灾的有效防治提供科学依据。一、飞蝗3个CYP4基因的分子特性及功能研究以飞蝗为材料,利用RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列。采用实时定量PCR技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织部位中mRNA的表达水平。结果表明,CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期,CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高；不同组织部位的定量PCR结果表明,CYP4C69、 CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达,CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性实验结果表明,双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后,点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比,没有显著提高。二、飞蝗CYP303A1分子特性及生物学功能分析利用RT-PCR技术克隆获得飞蝗CYP303A1 cDNA全长序列,并与已报道的昆虫物种CYP303A1进行比对分析并构建系统发育树,采用实时定量PCR技术分析该基因在五龄飞蝗不同组织部位和体壁不同发育阶段mRNA的表达水平,并应用RNA干扰技术研究CYP303A1对飞蝗蜕皮的影响。克隆获得飞蝗CYP303A1 cDNA全长序列,实时定量PCR技术分析该基因在五龄不同组织部位和发育时期的表达量,结果表明,CYP303A1在五龄若虫所有被检测的组织部位中均有表达,在前肠和体壁中的表达量显著高于其他组织；该基因在飞蝗五龄期若虫体壁发育过程中的表达变化显示：飞蝗蜕皮后1至6天CYP303A1表达量较低,第7天表达量达到最高。RNA干扰试验发现,五龄第2天若虫注射dsCYP303A1 24 h后,与对照组相比,CYP303A1 mRNA表达量被沉默了70.5%；表型观察结果显示,与对照组相比,注射dsCYP303A1的虫体出现龄期延长,脊线开裂,旧表皮不能顺利剥离而导致虫体扭曲,最终死亡。五龄若虫注射dsCYP303A1组死亡率为92.5%,与对照组相比差异显著。采用HE染色切片技术,观察飞蝗五龄若虫体壁结构变化,结果表明,dsCYP303A1处理后飞蝗新表皮合成受阻。实时定量PCR检测几丁质代谢通路上关键基因Gfat、UAP、CHS和GNA表达水平的变化,结果表明,与对照组相比,dsCYP303A1处理后飞蝗Gfat表达量显著降低。该基因表达量降低阻碍了几丁质的合成,从而影响新表皮的形成。三、飞蝗CYP303A1和细胞色素P450还原酶原核表达载体构建克隆获得飞蝗CPR cDNA全长核苷酸序列,采用ompA+2和pelB修饰策略构建CYP303A1和CPR原核表达载体。采用ompA+2修饰策略的优势在于不会改变CYP450 cDNA编码区,细菌通过自身蛋白水解作用将引导肽序列(ompA+2)和pelB水解,从而释放出完整的CYP450和CPR蛋白。