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第一部分KIF3A在儿童哮喘中的表达及与气道炎症的相关性研究目的KIF3A基因与哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎等免疫系统疾病密切相关,且KIF3A缺乏时可以加重哮喘小鼠的气道高反应(Airway hyperresponsiveness,AHR)及促进Th2介导的炎症反应。本研究拟探讨KIF3A基因在儿童哮喘患者中表达水平及分析KIF3A表达水平与气道炎症的相关性。方法1.选取重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心住院的哮喘儿童(Asthma组,25例)及同期同年龄段体检中心体检的健康儿童作为研究对象(Normal组,25例),2组患儿空腹抽取静脉血4ml及无菌毛刷取鼻腔粘膜细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)法检测2组儿童外周血细胞及鼻腔粘膜细胞中KIF3A m RNA的水平。2.选取25例哮喘急性发作期轻度儿童(Mild组)及25例哮喘急性发作期重度儿童(Severe组)作为研究对象,取其鼻腔粘膜细胞及外周血,q RT-PCR检测外周血细胞及鼻腔粘膜细胞中KIF3A m RNA水平,同时检测2组儿童血清IL-4、IL-5、IL-13及总Ig E水平,并分析KIF3A表达与血清IL-4、IL-5、IL-13及总Ig E水平相关性。结果1.外周血细胞中KIF3A表达情况,Asthma组KIF3A m RNA水平明显低于Normal组(P<0.05),鼻腔粘膜细胞中KIF3A m RNA水平Asthma组显著低于Normal组(P<0.05);2.Severe组儿童外周血细胞中KIF3A m RNA水平低于Mild组儿童,差异有统计学意义(P<0.05),鼻腔粘膜细胞中KIF3A m RNA水平Severe组显著低于Mild组(P<0.05)。血清总Ig E及IL-4、IL-5、IL-13检测结果显示,Severe组明显高于Mild组,差异有统计学意义(P<0.05);3.KIF3A与血清总Ig E、IL-4、IL-5、IL-13相关性分析发现,KIF3A表达水平与IL-4、IL-5、IL-13及血清总I g E水平呈负相关。结论1.KIF3A在哮喘儿童外周血及鼻腔粘膜细胞中表达下降;2.KIF3A在哮喘儿童中表达水平越低,哮喘儿童气道炎症越重。第二部分KIF3A基因与气道炎症及气道上皮细胞凋亡的相关性研究目的通过第一部分的研究我们发现KIF3A基因在哮喘儿童中低表达,且KIF3A表达水平与气道炎症密切相关。气道炎症及气道上皮细胞异常凋亡在哮喘发病机制中起到非常重要的作用,且我们前面的研究已证实KIF3A在哮喘儿童中低表达。KIF3A低表达时还可以导致多种细胞凋亡,目前已研究发现的有感光细胞、肾小管上皮细胞等。那么KIF3A低表达时是否会导致气道上皮细胞凋亡呢?因此,本研究将在第一部分研究的基础上进一步探讨:1.通过人支气管上皮细胞16HBE14o-研究KIF3A表达水平与气道炎症及气道上皮细胞凋亡的相关性;2.将BALB/C小鼠作为研究对象探讨KIF3A表达水平与气道炎症及气道上皮细胞凋亡的相关性。方法1.体外实验1)使用人支气管上皮细胞16HBE 14o-作为实验对象,实验分组:a、正常对照组,仅用lipo2000处理;b、阴性对照组,转染scramble-si RNA;c、si RNA1干扰组,转染特异性靶向KIF3A的si RNA;d、si RNA2干扰组,转染特异性靶向KIF3A的si RNA;e、Adv空载体对照组,用Adv空载体感染细胞株;f、KIF3A高表达组,用KIF3AAdv载体感染细胞株。2)WB检测验证各细胞分组构建是否成功;3)用重组人IL-4、IL-13和TNF-α诱导处理实验细胞后,Annexin V和PI双染,流式细胞仪测定细胞凋亡;4)q RT-PCR检测各组细胞炎症指标CCL17、CCL26及IL-5、IL-8水平。2.体内实验1)将BALB/C小鼠作为研究对象,建立小鼠哮喘模型;2)模型建立后通过小鼠行为学表现、AHR检测、血清总Ig E检测、BALF中炎症细胞计数及肺组织HE染色验证BALB/C哮喘小鼠模型是否建立成功;3)使用携带KIF3A基因的Adv载体转染哮喘小鼠构建KIF3A高表达组(OVA+KIF3A组),利用Adv空载体转染哮喘小鼠作为KIF3A基因低表达组(OVA组)及正常小鼠转染Adv空载体作为对照(Normal组);4)q RT-PCR及WB检测3组小鼠气道上皮中KIF3A表达,TUNEL检测气道上皮细胞凋亡,q RT-PCR及ELISA检测3组小鼠肺组织中及BALF中相关炎症因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平;5)分析KIF3A表达与气道炎症因子和气道上皮细胞凋亡的相关性。结果1.体外实验:1)细胞凋亡分析发现KIF3A低表达后细胞凋亡明显增加,而KIF3A表达增高后可以显著减少细胞凋亡的数量(P<0.05);2)q RT-PCR结果显示,KIF3A低表达时炎症指标CCL17、CCL26、IL-5及IL-8明显增高,而KIF3A表达增高后CCL17、CCL26、IL-5及IL-8水平显著下降(P<0.05)。2.体内实验:1)q RT-PCR及WB检测结果显示,3组小鼠KIF3A差异表达构建成功(P<0.05);2)TENUL检测发现,KIF3A低表达后细胞凋亡数量明显增多,KIF3A表达增高后可减少细胞凋亡数量(P<0.05);3)3组小鼠肺组织及BALF中相关炎症因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-8、TNF-α检测结果显示KIF3A低表达时炎症因子水平明显增高,KIF3A表达增高后可显著降低炎症因子水平(P<0.05);4)KIF3A表达与细胞凋亡相关性分析显示,KIF3A表达越低细胞凋亡越明显;5)KIF3A表达与炎症因子相关性分析显示,KIF3A表达水平与炎症因子IL-4、IL-5、IL-13及血清总Ig E水平呈负相关。结论KIF3A基因在哮喘中低表达,且KIF3A表达水平与哮喘气道炎症及气道上皮细胞凋亡密切相关,KIF3A表达水平越低,气道炎症越重且气道上皮细胞凋亡越明显。