肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病，对人类生存与健康构成了巨大的威胁。DNA甲基化可以调控基因的表达，5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，AZA)作为DNA甲基化转移酶抑制剂可以抑制基因的DNA甲基化，诱导被甲基化的基因表达。AZ具有明显的抗肿瘤作用，是一种白血病临床治疗药物。最新研究表明，AZA抗肿瘤的机制是激活抑癌基因和依赖双链RNA的先天免疫相关基因。然而，是否存在其他机制，目前尚不清楚。反义RNA是一种与已知基因正义RNA链互补的内源性转录本，作为一类重要的调控因子，可在转录水平或转录后水平参与基因的表达调控。虽然不少证据显示许多基因具有反义RNA，包括与癌症相关的基因，但大部分反义RNA的功能以及反义RNA在癌症治疗中的作用，相关研究仍相当欠缺。本研究首先构建了人肝癌细胞的双链RNA(dsRNA)文库，然后从中挑选一些具有代表性的dsRNA进行更深入的研究，以揭示dsRNA是否介导AZA的抗癌作用。主要的研究方法与结果如下:　　1.双链RNA文库的构建:通过DNA甲基化转移酶抑制剂AZA处理人肝癌细胞，以构建双链RNA(Double stranded RNA，dsRNA)文库。实验组用溶解于DMSO的AZA处理人肝癌HepG2细胞，而对照组仅用DMSO处理。处理48小时后分别提取总RNA，经DNA酶处理后进行反转录形成cDNA，然后进行RNA酶处理，体外杂交形成双链DNA，以及单链DNA酶处理，最后通过高通量测序获得dsRNA文库的序列。数据表明，一共筛选到2364个基因的dsRNA，其中实验组2066个，对照组843个。其中，545个为实验组与对照组共有（相对于对照组，实验组有391个为上调，154个为下调）。　　2.通路分析:分析结果表明，在未经AZA处理的HepG2细胞中，能够形成dsRNA的基因主要富集在代谢和增殖相关通路，尤其是‘Protein processing in endoplasmic reticulum’和‘Cell cycle’路径。而在AZA处理的HepG2细胞中，dsRNA除了分布在与对照组细胞共有的路径外，还分布于其他信号通路，如与癌症发生发展相关的信号通路(Pathway incancer、TGF-beta signaling pathway、pancreatic pathway)、与细胞生长相关的通路(Hipposignal pathway)。其中，dsRNA富集最多的是癌症相关通路(Pathway in cancer)，其次是亨丁顿舞蹈症(Huntingtons disease)和内质网（Protein processing in endophsmic reticulum）蛋白修饰相关通路。　　3.双链RNA文库验证:从上述双链RNA文库中挑选出一些代表性反义RNA的基因，抑癌基因第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)和先天免疫相关基因信号转导及转录激活因子1(STAT1)基因、Ras样原癌基因B(RALB)和致癌基因MET、癌相关基因CD44和热休克蛋白A4(HSPA4)。采用链特异性RT-PCR鉴定细胞中这六个基因是否存在反义RNA。结果表明这六个基因都存在正、反义RNA的表达，有力地证明了上述双链RNA文库构建的有效性。　　4.反义RNA介导AZA的抗癌作用:采用实时荧光定量PCR法分析上述六个基因（PTEN、STAT1、RALB、MET、 CD44、HSPA4）正、反义RNA的表达情况。结果表明AZA激活了这六个基因的反义RNA表达(P＜0.01)。同时，AZA促进了抑癌基因PTEN和先天免疫相关基因STAT1的正义RNA表达(P＜0.01，P＜0.001)而癌相关基因CD44和HSPA4的正义RNA表达受到明显抑制(P＜0.01)。　　综上所述，双链RNA文库的构建为研究反义RNA在肝癌发生中的作用及机制提供了重要资源。通过对文库中代表性反义RNA的深入研究，不仅证实了AZ原有的抗癌机制，即AZA可激活抑癌基因和先天免疫基因的表达，而且揭示AZ可通过激活反义RNA，抑制致癌基因和癌相关基因表达的抗癌新机制。