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研究背景恶性肿瘤(尤其是肺癌)是严重危害人类健康的疾病，手术和放化疗作为传统的治疗手段，疗效有限，难以完全清除癌细胞，且对机体有明显毒副作用，易产生多种并发症。目前，提高生活质量和生存期已成为肿瘤治疗的首要原则，故T淋巴细胞过继免疫治疗逐渐受到临床医师的高度重视。CD8~+T淋巴细胞是特异性抗肿瘤免疫应答的关键细胞，探讨和阐明CD8~+T淋巴细胞的调控机制，对于肿瘤免疫治疗的研究具有重大价值。作为CD8~+T淋巴细胞的亚群细胞，效应性T淋巴细胞(effector T cells, Te)和记忆性T淋巴细胞(memory T cells,Tm)具有完全不同的生物学活性。Te是杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞，但在发挥免疫作用后的较短时间内发生自我凋亡；Tm的功能状态相对静止，但具有自我稳定更新的能力，可以长期存活二级淋巴组织中，直到再次接触相同的抗原后产生强烈的二次免疫应答。另一方面，已有大量的研究证实微小RNA(microRNAs, miRNA)在适应性免疫应答的精细调控中发挥了重要作用。结合以上理论，我们设想，通过比较荷瘤(Lewis肺癌)小鼠脾脏CD8~+Te和Tm的miRNA表达谱，分析二者之间明显差异表达的miRNA并从中筛选出参与调控CD8~+T淋巴细胞免疫应答的miRNA作为研究目标，有可能进一步实现调控CD8~+T淋巴细胞的抗肿瘤活性，并为特异性肿瘤细胞免疫的机制研究提供新的思路。目的本课题拟分离荷瘤小鼠脾脏的Te和Tm，比较二者的miRNA表达谱芯片，在明显差异表达的miRNAs中确定参与调控CD8~+T淋巴细胞功能的目标miRNA，并分析目标miRNA对CD8~+T淋巴细胞的作用机制和其相应的下游靶基因。方法1.应用Lewis肺癌细胞建立C57BL/6荷瘤小鼠模型，分离并纯化荷瘤小鼠脾脏的CD8~+Te和CD8~+Tm，分析它们的miRNA表达谱并经qRT-PCR验证，选择二者间差异表达的miRNA(miRNA-15b)作为研究对象。2.观察miRNA-15b在健康小鼠和荷瘤小鼠的CD8~+T淋巴细胞之间表达有无差异，并观察miRNA-15b在CD8~+T淋巴细胞活化过程中的含量变化情况。3.通过人工合成的miRNA-15b mimic转染CD8~+T淋巴细胞，实现miRNA-15b在体外CD8~+T淋巴细胞中的过表达。4.通过细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞术、ELISA检测试剂盒和CFSE增殖试剂盒在体外检测过表达miRNA-15b对CD8~+T淋巴细胞的凋亡、细胞因子分泌、(活化和记忆)表型以及增殖等功能的影响。5.通过生物信息学软件和双荧光素酶报告实验进一步筛选和验证miRNA-15b潜在的，且与T淋巴细胞功能相关的下游靶基因。结果1. miRNA表达谱芯片分析和qRT-PCR证实miRNA-15b在荷瘤小鼠脾脏的CD8~+Tm中的含量明显高于CD8~+Te(3倍以上)。2. miRNA-15b(较之健康小鼠)高表达于荷瘤小鼠的脾脏CD8~+T淋巴细胞。3. miRNA-15b在CD8~+T淋巴细胞中的表达含量与CD8~+T淋巴细胞自身的活化程度呈负相关。4.过表达的miRNA-15b能增强CD8~+T淋巴细胞的抗凋亡能力。5. miRNA-15b能通过一些尚未明确的靶点或机制抑制CD8~+T淋巴细胞的活化(包括抑制其分泌IL-2和IFN-γ，抑制CD69的表达)，并促进CD8~+T淋巴细胞的记忆性表型(CD44)表达。6.过表达的miRNA-15b未对CD8~+T淋巴细胞的增殖产生明显的调控作用。7. DEDD是miRNA-15b的一个靶基因，过表达的miRNA-15b能抑制CD8~+T淋巴细胞中DEDD的表达。结论肿瘤环境能促使小鼠脾脏CD8~+T淋巴细胞中miRNA-15b的含量上调，同时体外高表达的miRNA-15b能抑制CD8~+T淋巴细胞的活化(包括抑制CD8~+T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ，抑制CD8~+T淋巴细胞表面活化分子CD69的表达)；另一方面，miRNA-15b能抑制靶基因DEDD，增强CD8~+T淋巴细胞的抗凋亡能力，并促进CD8~+T淋巴细胞表面记忆性分子CD44的表达。总结目前的研究结果，miRNA-15b可能对CD8~+T淋巴细胞的抗肿瘤免疫功能具有双重效应，包括对T淋巴细胞的活化发挥了明显的负调控作用，但同时有可能通过诱导CD8~+T淋巴细胞向Tm分化而有助于肿瘤免疫记忆的建立。miRNA-15b有可能成为肿瘤免疫潜在的诊治靶点。