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口腔种植义齿追溯其起源已有上千年历史,随着种植体设计的不断革新、外科技术的不断成熟以及人们生活水平和口腔保健意识的不断提高,近来口腔种植义齿已成为口腔常见修复技术。种植义齿的成功率取决于种植体与骨界面之间的良好整合过程,而该过程则需要种植区有足够的牙槽骨骨量。但在临床工作中,常见由于先天发育不足、外伤、肿瘤或拔牙后牙槽骨吸收、萎缩等原因造成种植区骨量不足,而无法满足种植手术适应症的患者。如何解决种植区的骨量不足问题,一直是口腔种植领域关注的焦点。大量研究表明间充质干细胞(MSCs)在促进骨再生方面具有显著的作用效果,但MSCs在维持生物活性、生物活性物质定量以及安全性等方面存在众多问题。因此,寻找具有相似功效的无细胞疗法成为当前研究热点,在国内外学者的进一步研究中发现,MSCs治疗的巨大价值是通过旁分泌因子实现的,而外泌体是细胞旁分泌的主要体现方式,且几乎保留了MSCs的所有优势,无需担心MSCs的并发症,显示出广阔的应用前景。应用外泌体等功能活性物质修复受损组织尚需解决生物载体问题,即如何使外泌体有效地聚集在组织缺损处持续发挥作用。水凝胶是以水为介质的三维网络交联结构,水凝胶具有卓越的生物相容性以及组织相似性,在生物医用材料中广泛应用,但传统水凝胶如明胶、纤维蛋白胶、透明质酸等,在复杂的生理环境下,很容易因机械形变而产生破损,影响其力学性能,以及缓释作用。与传统水凝胶相比,自愈性水凝胶赋予了水凝胶自愈合性能,破损的水凝胶能够在短时间内进行自我修复,这将增强材料的使用寿命、安全性以及缓释作用。先前基于亚胺键的壳聚糖基多响应性自愈性水凝胶已被广泛研究,作为凝胶因子的双端苯甲醛基封端的遥爪聚乙二醇(DF-PEG)与聚乙二醇壳聚糖(GCS)溶液混合后,可以在短时间内形成亚胺键制备得到自愈性水凝胶,考虑到骨移植材料的特殊要求,我们对该自愈性水凝胶进行改性,在壳聚糖基自愈性水凝胶的基础上添加了与骨无机成分相似的且具有高生物活性、良好生物相容性的珊瑚源羟基磷灰石(CHA)以及与CHA具有高度亲和力的且在骨组织工程广泛应用的丝素(SF)材料。使的材料与材料之间形成优势互补以满足骨移植材料所需的理化性能和生物活性。通过体内外实验,对人脐带间充质干细胞(hucMSCs)源外泌体(hucMSC-Exos)与自愈性水凝胶复合材料对骨再生作用进行了较为充分的研究,以期为解决临床种植区骨量不足提供新的技术策略和方法。本实验主要分为以下四个部分进行。第一部分提取并鉴定人脐带间充质干细胞源外泌体目的:体外从人脐带组织中分离、培养hucMSCs,提取鉴定hucMSC-Exos,为后续实验奠定基础。方法:组织块贴壁法从人脐带组织中分离培养hucMSCs,并对细胞形态、细胞表面特征性标记物以及多向分化潜能进行检测。收集hucMSCs培养上清液,采用低温超高速离心法收集hucMSC-Exos,通过透射电镜(TEM)鉴定外泌体的大小和形态,Western Blot鉴定外泌体表面的特征性标志物CD9、CD63。结果:成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能,hucMSCs细胞强表达CD44、CD73,极低表达CD45、CD31。Huc MSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小集中在80 nm左右,阳性表达CD9,CD63。结论:本部分实验成功的提取了hucMSCs及其来源外泌体,为后续实验提供可靠稳定的移植源。第二部分hucMSC-Exos对前成骨细胞及人脐静脉血管内皮细胞生物学行为的影响目的:检测hucMSC-Exos对小鼠成骨前体细胞(m OPCs)及人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)生物学行为的影响。方法:采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度梯度hucMSC-Exos对m OPCs增殖的影响。通过碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-Exos对m OPCs成骨分化作用的影响。采用CCK8试剂盒和细胞划痕实验检测不同浓度梯度hu MSC-Exos对HUVECs增殖和迁移的影响。结果:1.CCK8法结果显示25μg/ml、50μg/ml的hucMSC-Exos可以显著的促进m OPC在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现25μg/ml和50μg/ml的hucMSC-Exos组可以明显提高了m OPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且50μg/ml的外泌体浓度作用强于25μg/ml(P<0.05)。2.CCK8和细胞划痕实验结果显示25μg/ml与50μg/ml的hu MSC-Exos组可以明显的促进HUVECs的体外增殖和迁移,且呈现浓度依赖效应,各组间均有统计学差异(P<0.05)。结论:1、hucMSC-Exos以浓度依赖的方式促进m OPCs的增殖与成骨分化。2、huMSC-Exos能有效促进HUVECs的增殖、迁移。第三部分珊瑚来源羟基磷灰石/丝素/乙二醇壳聚糖/DF-PEG水凝胶的制备与表征目的:制备并评估一种以DF-PEG作为凝胶因子以CHA、SF、GCS为基体材料的新型自愈性水凝胶材料作为医用材料的可行性。方法:室温下将DF-PEG作为凝胶因子与CHA/SF/GCS的水溶液进行混合,60s内迅速形成CHA/SF/GCS/DF-PEG水凝胶。通过扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)以及接触角和自愈性实验对CHA/SF/GCS/DF-PEG水凝胶的结构和理化特性进行表征。接种m OPCs对水凝胶材料的细胞毒性和细胞相容性进行评价。结果:CHA/SF/GCS/DF-PEG水凝胶孔隙大小一致、形态规则、孔隙间具有良好的连通性且孔壁厚度均匀、表面光滑。FT-IR及XRD结果表明成功的制备了珊瑚源羟基磷灰石,FT-IR结果显示合成水凝胶可见明显的亚胺键与磷酸基团的吸收峰。MTT结果显示水凝胶无毒,包封于水凝胶中的m OPCs存活和增殖状态良好3 d时细胞存活率仍在90%以上,增殖率高达95%,具有良好的细胞相容性。结论:成功地制备了自愈性CHA/SF/GCS/DF-PEG水凝胶,该水凝胶综合性能优异,有望成为一种新型医用水凝胶材料。第四部分:hucMSC-Exos联合CHA/SF/CGS/DF-PEG水凝胶对大鼠股骨髁缺损修复作用评价目的:建立大鼠股骨髁缺损模型,将hucMSC-Exos负载于CHA/SF/CGS/DF-PEG水凝胶内,评价其对骨缺损修复作用。方法:54只SD大鼠构建股骨髁缺损模型,随机分为3组,PBS修复组(Control组);单纯的CHA/SF/CGS/DF-PEG水凝胶修复组(Hydrogel组);添加hucMSC-Exos的CHA/SF/CGS/DF-PEG水凝胶的修复组(Hydrogel-exosomes组)。通过大体观察、X线片、micro-CT检测,组织切片染色,评估比较术后30 d、60 d、90 d的骨愈合情况。结果:通过大体观察、X线片、micro-CT检测,组织切片染色结果显示,Hydrogel-exosomes组骨愈合率高于其他两组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Hydrogel组骨愈合率高于空白对照组,差距亦具有统计学意义(P<0.05)结论:CHA/SF/CGS/DF-PEG水凝胶具有骨修复效果,添加hucMSC-Exos后骨修复效果更加显著。