背景和目的神经干细胞（NSCs）具有自我更新和多向分化潜能。在疾病和损伤情况下,NSCs具有增殖、迁移,并向星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元分化的能力,已成为再生研究和神经功能损伤修复的热点,但由于免疫排斥问题及伦理方面的限制,其临床应用仍较困难。随着细胞生物学技术的发展,已经可以做到从胎鼠、成鼠及人类胚胎的多个区域分离得到NSCs,但鲜有文献报道从成人脑组织中获取NSCs。本课题通过改良原代培养方法在颅脑手术患者的废弃脑组织中分离培养NSCs,体外扩增后冻存,建立自体NSCs库;观察自体NSC的体外干性维持及谱系发育过程,并进行定向诱导分化研究,为术后神经功能缺失的颅脑损伤和脑卒中患者提供符合伦理要求的自体NSCs移植平台。方法（1）成人自体神经干细胞的改良原代培养:收集25例颅脑手术中废弃脑组织各约500 mg,用10ml注射器推出组织至培养皿,滴管轻柔吹打均匀至约10-500μm直径的组织碎片,离心（1000r/min,5min）弃上清,按1∶40（1 g组织:40 mL完全培养液）添加5 ml完全培养液(DMEM/F12、体积分数2%B₂₇、质量浓度20ng/ml EGF、20 ng/ml FGF、体积分数1%双抗)接种至25cm²的培养瓶中,置入37℃5%CO₂恒温培养箱培养。（2）成人自体神经干细胞的传代培养:培养获得的神经干细胞球添加含体积分数2%胎牛血清（FBS）培养液（DMEM/F12、体积分数2%FBS、质量浓度20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF、体积分数1%双抗）诱导其贴壁生长。待细胞增殖达到一定数量后,弃上清,添加2ml accutase酶消化5min,离心（1000r/min,5min）弃上清;添加2%胎牛血清培养液,调整细胞浓度至1×10⁹/L,接种至25 cm²培养瓶,放至37℃5%CO₂恒温培养箱培养。每隔2-3天将贴壁细胞消化制作单细胞悬液,按1∶2或者1∶3进行扩增传代。（3）成人自体神经干细胞的诱导分化:将添加有10%胎牛血清完全培养液（DMEM/F12、体积分数10%FBS、体积分数1%双抗）的细胞悬液调整细胞浓度至1×10⁹/L,接种至25 cm²培养瓶中,置于37℃5%CO₂恒温培养箱培养。每隔3 d半量换液,加等量10%胎牛血清培养液。（4）成人自体神经干细胞及诱导分化后细胞鉴定:通过免疫荧光细胞化学技术及蛋白质免疫印迹技术（WB）检测巢蛋白（Nestin,标记神经干细胞）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP,标记星形胶质样细胞）,β-tubulinⅢ（标记神经元样细胞）,SOX10（标记少突胶质样细胞）蛋白的表达。（5）成人自体神经干细胞的冻存与复苏:将细胞悬液调整细胞浓度至1×10⁹/L,转移至冻存管置于冻存盒-80℃过夜冻存,次日置于液氮罐冻存。复苏时,将冻存管迅速转移至37℃水浴箱,添加5ml的神经干细胞完全培养基重悬细胞,离心弃上清,添加5ml的神经干细胞完全培养基再次重悬,接种于25cm²培养瓶,观察细胞存活情况,置于37℃5%CO₂恒温培养箱培养。结果（1）成人自体神经干细胞改良原代培养后神经球生长情况:25例颅脑手术废弃脑组织,在无血清悬浮培养3d后,其中15例在倒置显微镜下均可见数个细胞团,悬浮生长,形态规则。培养5 d后,细胞团体积不断增大,逐渐形成神经球。培养6-7d神经球即可传代。（2）神经球的Nestin免疫荧光鉴定结果:将神经球经神经干细胞特异性标志物Nestin染色,荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察,均呈阳性表达。（3）成人自体神经干细胞的诱导分化情况及诱导后细胞的鉴定结果:将神经球接种于分化培养基培养1h后细胞贴壁,3d后大量细胞长出突起。7d后进行细胞鉴定可见?-Ⅲ-Tubulin阳性表达的神经元样细胞、SOX10阳性表达的少突胶质样细胞及GFAP阳性表达的星形胶质样细胞。（4）成人自体神经干细胞的冻存与复苏:将培养获得的神经干细胞,传代后分代冻存。对每代细胞进行抽样复苏,观察见细胞存活良好,且可继续传代。目前尚有冻存细胞66份,并详细标注细胞来源、培养代数及冻存日期等信息,建库保存。结论本研究采用改良原代培养法成功从颅脑手术废弃脑组织中培养获得成人自体神经干细胞球,获取率达60%（15/25）。诱导分化后可向神经元样细胞、少突胶质样细胞及星形胶质样细胞分化。冻存复苏后仍维持其干细胞特性,并可大量传代扩增。为颅脑损伤及脑卒中术后神经功能障碍患者提供既符合伦理要求又能避免免疫排斥反应的自体神经干细胞移植治疗平台。