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毛竹(Phyllostachvs edulis)是我国重要的笋材两用竹种，广泛分布我国亚热带地区，占全国竹林面积的70％以上，具有重要经济、生态和社会价值。作为多年生单稔植物，一生只开一次花，开花后竹林更新能力下降，叶片衰老脱落和植株个体死亡。开花衰老对竹区经济发展和生态环境造成巨大的影响。NAC蛋白是植物特有的一类转录因子，其中ORE1和NAP蛋白在植物的生长发育、整株衰老和器官衰老调控方面具有至关重要的作用。然而有关NAC家族基因调控衰老的研究多集中在一年生的模式植物或农作物上，在毛竹上的研究极少，且有关ORE1和NAP成员在毛竹衰老方面的研究仅限于进化分析和基因PeNAC1（NAP亚家族成员）的克隆，缺乏调控功能解析。因此挖掘毛竹衰老相关的NAC（PheNAC）基因，研究NAC基因对毛竹衰老调控机理，具有重要的理论意义和实践价值。本研究以毛竹花的衰老、叶片衰老和笋采后衰老为切入点，筛选与衰老相关的候选NAC家族基因;用遗传学实验验证其功能;通过酵母单杂交和酵母双杂交实验，解析NAC基因的调控机制。主要研究结果如下:
1、毛竹ORE1和NAP亚家族成员为候选衰老相关基因
根据基因组测序结果筛选和鉴定毛竹NAC家族基因，筛选得到112条PheNACs基因。基于系统进化模式及拟南芥和水稻中同源基因的功能，预测毛竹的NAC家族成员参与形态建成、次生壁加厚、胁迫响应和衰老调控。对其在花发育、笋发育和笋采后衰老过程的表达模式进行分析，结果表明胁迫相关的NAP亚家族和发育相关的ORE1亚家族的成员参与这两种衰老过程。另外，干旱胁迫和盐胁迫后SNAC亚家族中NAP的同源基因显著上调，说明NAP的同源基因可能参与毛竹的胁迫响应。
2、衰老相关ORE1和NAP亚家族成员参与毛竹叶片和笋采后衰老过程
克隆共获得7个PheNACs基因和一个可变剪接转录本，分别命名为PheNAC5-11和PheNAC6S（可变剪接转录本）。PheNA C5-7属于NAM亚家族，与拟南芥的ORE1基因有较高的相似性。PheNAC8-11属于NAP亚家族。表达分析发现PheNAC5-11和PheNAC6S这8个基因在衰老过程（叶片自然衰老、4种激素或激素前体（ABA、ACC、MejA和SA)诱导衰老、黑暗诱导衰老或笋采后衰老）均上调表达，仅PheNAC11在实生苗叶片衰老过程表达水平基本不变，而在另外几种衰老过程中均显著上调。
3、PheORE1s和PheNAPs能够诱导或延迟拟南芥叶片衰老
PheORE1亚家族成员PheNAC6-7在野生型拟南芥和拟南芥nac2-1突变体中异源表达，结果显示在自然条件和ACC诱导PheNAC6的转基因植株的离体叶片后均没有呈现明显延迟或衰老表型。ACC处理后，异位表达PheNAC6S的转基因植株的离体叶片延迟失绿，说明PheNAC6S在ACC诱导衰老的过程中起负调控。ACC处理后，异位表达PheNAC7的转基因植株的离体叶片失绿进程早于突变体和野生型，说明PheNAC7参与ACC诱导衰老的过程。
PheNAP亚家族成员PheNAC9-11在拟南芥中异源表达，结果显示在自然条件下PheNAC10在野生型拟南芥中过表达能够导致转基因植株提前衰老，在nap突变体中异源表达能恢复突变体的滞绿表型。在野生型和nap突变体中过表达PheNAC11的转基因植株没有明显表型。ABA诱导处理显示PheNAC10和PheNAC11的异源表达转基因植株的离体叶片均变黄，然而突变体呈现滞绿表型，这说明PheNAC10在拟南芥叶片在自然条件和ABA诱导衰老过程中起正调控作用，PheNAC11只参与ABA诱导衰老的调控。相反，PheNAC9在野生型拟南芥和突变体中异源表达均延迟衰老，ABA诱导后离体叶片呈现滞绿表型，因此PheNAC9可能负调控叶片的衰老。
4、衰老相关OREls和NAPs直接结合PheABCG40-1、PheSAG12或PheNYC3的启动子
通过亚细胞定位实验，发现PheNAC5-11均为核定位蛋白。PheNAC6S是PheNAC6的可变剪切体，其翻译的蛋白属于泛定位蛋白。通过转录激活实验，发现PheNAC6S和PheNAC9没有转录激活活性，其余6个PheNACs均和己报道的其他它物种的同源基因一样都具有转录激活活性。说明衰老相关ORE1s和NAPs家族成员可以作为转录因子参与调控。酵母单杂实验发现OREls和NAPs家族成员能直接或间接调控候选ABA路径相关基因（PheABCG40-1）、衰老相关基因（PheSAG12）和叶绿体降解基因（PheNYC3），进而调控叶片的衰老，由于PheNAC6能够结合PheABCG40-1的启动子，而PheNAC6S和PheNAC10都能结合PheSAG12和PheNAC9的启动子，也再次说明这两个可变剪接转录本可能具有不同的功能。PheNAC9作为PheNAC6S和PheNAC7（ORE1亚家族）和PheNAC10（NAP亚家族）共同的下游基因，同时PheNAC9蛋白能直接结合PheNYC的启动子，并可以与PheNAC8(NAP亚家族)互作形成异源二聚体，这说明ORE1s和NAPs在调控衰老的过程中存在一个复杂的调控网络，PheNAC9是这两个亚家族调控衰老的候选节点基因。
5、衰老相关OREls和NAPs可能参与多种调控过程
通过酵母单杂交实验和候选NAC结合元件多序列比对分析，显示毛竹衰老相关OREls和NAPs的NAC结合元件含有相对保守TACG[G/T][T/G]或GTCA[A/C]核心序列，其与已报道的NAC结合元件含有CGT[GA]核心序列存在差异。基于NAC结合元件在全基因组水平筛选候选下游基因，候选下游基因的功能注释结果显示其可能与开花时间调控、激素响应、生物和非生物胁迫应答有关。因此衰老相关OREls和NAPs可能参与多种调控过程。
综上所述:本研究基于毛竹NAC家族进化、结构和表达模式分析，选定ORE1s和NAPs亚家族成员为候选衰老相关基因。通过克隆获得7个PheNACs基因和一个可变剪接转录本，这8个基因参与毛竹不同组织的衰老过程，并能正或负调控拟南芥叶片的哀老。候选基因能够调控ABA路径相关基因或叶绿体降解相关基因，其中PheNAC9是ORE1和NAP两个亚家族调控衰老的节点基因。这些结果推动了毛竹叶片衰老的分子机制研究。
1、毛竹ORE1和NAP亚家族成员为候选衰老相关基因
根据基因组测序结果筛选和鉴定毛竹NAC家族基因，筛选得到112条PheNACs基因。基于系统进化模式及拟南芥和水稻中同源基因的功能，预测毛竹的NAC家族成员参与形态建成、次生壁加厚、胁迫响应和衰老调控。对其在花发育、笋发育和笋采后衰老过程的表达模式进行分析，结果表明胁迫相关的NAP亚家族和发育相关的ORE1亚家族的成员参与这两种衰老过程。另外，干旱胁迫和盐胁迫后SNAC亚家族中NAP的同源基因显著上调，说明NAP的同源基因可能参与毛竹的胁迫响应。
2、衰老相关ORE1和NAP亚家族成员参与毛竹叶片和笋采后衰老过程
克隆共获得7个PheNACs基因和一个可变剪接转录本，分别命名为PheNAC5-11和PheNAC6S（可变剪接转录本）。PheNA C5-7属于NAM亚家族，与拟南芥的ORE1基因有较高的相似性。PheNAC8-11属于NAP亚家族。表达分析发现PheNAC5-11和PheNAC6S这8个基因在衰老过程（叶片自然衰老、4种激素或激素前体（ABA、ACC、MejA和SA)诱导衰老、黑暗诱导衰老或笋采后衰老）均上调表达，仅PheNAC11在实生苗叶片衰老过程表达水平基本不变，而在另外几种衰老过程中均显著上调。
3、PheORE1s和PheNAPs能够诱导或延迟拟南芥叶片衰老
PheORE1亚家族成员PheNAC6-7在野生型拟南芥和拟南芥nac2-1突变体中异源表达，结果显示在自然条件和ACC诱导PheNAC6的转基因植株的离体叶片后均没有呈现明显延迟或衰老表型。ACC处理后，异位表达PheNAC6S的转基因植株的离体叶片延迟失绿，说明PheNAC6S在ACC诱导衰老的过程中起负调控。ACC处理后，异位表达PheNAC7的转基因植株的离体叶片失绿进程早于突变体和野生型，说明PheNAC7参与ACC诱导衰老的过程。
PheNAP亚家族成员PheNAC9-11在拟南芥中异源表达，结果显示在自然条件下PheNAC10在野生型拟南芥中过表达能够导致转基因植株提前衰老，在nap突变体中异源表达能恢复突变体的滞绿表型。在野生型和nap突变体中过表达PheNAC11的转基因植株没有明显表型。ABA诱导处理显示PheNAC10和PheNAC11的异源表达转基因植株的离体叶片均变黄，然而突变体呈现滞绿表型，这说明PheNAC10在拟南芥叶片在自然条件和ABA诱导衰老过程中起正调控作用，PheNAC11只参与ABA诱导衰老的调控。相反，PheNAC9在野生型拟南芥和突变体中异源表达均延迟衰老，ABA诱导后离体叶片呈现滞绿表型，因此PheNAC9可能负调控叶片的衰老。
4、衰老相关OREls和NAPs直接结合PheABCG40-1、PheSAG12或PheNYC3的启动子
通过亚细胞定位实验，发现PheNAC5-11均为核定位蛋白。PheNAC6S是PheNAC6的可变剪切体，其翻译的蛋白属于泛定位蛋白。通过转录激活实验，发现PheNAC6S和PheNAC9没有转录激活活性，其余6个PheNACs均和己报道的其他它物种的同源基因一样都具有转录激活活性。说明衰老相关ORE1s和NAPs家族成员可以作为转录因子参与调控。酵母单杂实验发现OREls和NAPs家族成员能直接或间接调控候选ABA路径相关基因（PheABCG40-1）、衰老相关基因（PheSAG12）和叶绿体降解基因（PheNYC3），进而调控叶片的衰老，由于PheNAC6能够结合PheABCG40-1的启动子，而PheNAC6S和PheNAC10都能结合PheSAG12和PheNAC9的启动子，也再次说明这两个可变剪接转录本可能具有不同的功能。PheNAC9作为PheNAC6S和PheNAC7（ORE1亚家族）和PheNAC10（NAP亚家族）共同的下游基因，同时PheNAC9蛋白能直接结合PheNYC的启动子，并可以与PheNAC8(NAP亚家族)互作形成异源二聚体，这说明ORE1s和NAPs在调控衰老的过程中存在一个复杂的调控网络，PheNAC9是这两个亚家族调控衰老的候选节点基因。
5、衰老相关OREls和NAPs可能参与多种调控过程
通过酵母单杂交实验和候选NAC结合元件多序列比对分析，显示毛竹衰老相关OREls和NAPs的NAC结合元件含有相对保守TACG[G/T][T/G]或GTCA[A/C]核心序列，其与已报道的NAC结合元件含有CGT[GA]核心序列存在差异。基于NAC结合元件在全基因组水平筛选候选下游基因，候选下游基因的功能注释结果显示其可能与开花时间调控、激素响应、生物和非生物胁迫应答有关。因此衰老相关OREls和NAPs可能参与多种调控过程。
综上所述:本研究基于毛竹NAC家族进化、结构和表达模式分析，选定ORE1s和NAPs亚家族成员为候选衰老相关基因。通过克隆获得7个PheNACs基因和一个可变剪接转录本，这8个基因参与毛竹不同组织的衰老过程，并能正或负调控拟南芥叶片的哀老。候选基因能够调控ABA路径相关基因或叶绿体降解相关基因，其中PheNAC9是ORE1和NAP两个亚家族调控衰老的节点基因。这些结果推动了毛竹叶片衰老的分子机制研究。