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西南桦(Betula alnoides Buch.-Ham.ex D.Don)为我国热带和南亚热带地区造林面积最大的乡土阔叶树种之一。因其树干通直以及木材材质优良、纹理美观、易于加工等特性,多用于制作高档家具、木地板等,经济价值较高。西南桦亦是华南地区生态公益林的主要树种之一,具有重要的生态价值。对于珍贵树种而言,传统的育种方法需要较长时间才能获得优良种质,而常规育种与分子标记技术相结合,有助于缩短育种周期,提高良种选育效率。
本研究以10年生西南桦种源/家系林中26个种源153个家系共364单株为对象,测定生长(树高、胸径、材积、冠幅和枝下高)、形质(冠型、干形和分枝)和材性(基本密度)9个性状,分析其变异规律,并进行优良种质选择;基于西南桦基因组高通量测序,开发大量多态性SSR标记;运用SSR标记揭示西南桦种质资源的遗传多样性及遗传结构;通过关联分析检测与目标性状显著关联的SSR标记,探讨这些性状的遗传学基础,发掘与性状显著关联的功能基因;还探讨了关联分析结果在分子标记辅助选择育种上的应用。主要结果如下:
(1)揭示生长、形质和材性性状变异规律,开展优良种质的联合选择。各性状变异系数的变化范围为14.84%-72.61%,其中材积、冠型、干形和分枝的变异系数均大于50%,变异丰富,具有较大的选择潜力。相关性分析表明,大多数性状间均呈显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)的正相关;分枝和基本密度与其它性状相关性较小,需进行独立选择:生长性状中树高和胸径间显著正相关,可择其一进行评价;形质性状中冠型与其余指标相关性密切,在选择时可以不予考虑。应用综合评分和主成分分析两种选优方法筛选西南桦优良单株,以10%入选率各选出36株优良单株,通过两种方法比较最终筛选出20个优质速生型单株,其性状的现实增益为26.68%~145.24%,具有显著的优异性,可通过组培无性系化予以推广应用。
(2)运用高通量测序技术开发西南桦基因组微卫星分子标记。通过西南桦基因组的De Novo测序,共搜索到164,357个候选SSR位点,其中单核苷酸重复最多(77.05%),其它依次为二(10.18%)、四(6.12%)、三(3.56%)、五(2.14%)和六(0.95%)核苷酸重复。通过这些候选位点设计出了2549对SSR引物,随机选取900对进行扩增和产物多态性检测。其中580对引物扩增成功,应用24个西南桦个体对这些引物的扩增产物进行检测,共获得了310个SSR多态性标记。所有位点的NA、HO、HE和I的均值分别为5.14、0.64、0.57和1.12,多态性较高。随机选取96对SSR引物应用于6个近缘种的扩增试验,发现其通用性较高。这些多态性标记可用于西南桦及其近缘种的群体遗传学和分子标记辅助育种研究。
(3)运用SSR引物研究西南桦种质资源的遗传多样性。32对引物共揭示出了189个等位基因,32个位点NA、Ho、HE及,的平均值分别为5.91、0.67、0.58和1.15,19个种源NA、HO、HE及I的平均值分别为6.30、0.66、0.60和0.96,其中云南双江种源的遗传多样性最高。选择出的20株优良单株,其遗传参数值略低于种水平。基于聚类分析,可将19个种源大致分为两大类,未反映出明显的地理分布特征。种源和优树的系统发育关系图中均大多在较大的遗传距离上聚在了一起,这表明种源和优树水平上均具有较高的遗传变异水平。上述结果说明这些种质材料可作为关联分析群体。
(4)运用208个SSR标记对西南桦种源/家系试验林的364个单株进行生长(树高、胸径、材积、冠幅和枝下高)、形质(冠型、干形和分枝)和材性(基本密度)9个性状的关联分析。通过群体遗传结构分析将364个个体分3个亚群。利用GLM和MLM两种模型进行关联分析,共检测出与树高、胸径、材积、冠幅、枝下高、冠型、干形、分枝和基本密度显著(p<0.05)关联的标记有15、9、7、11、17、5、9、6和18个,极显著(p<0.01)关联的标记有4、4、2、2、3、0、2、0、和6个,其中17个标记同时与两个或两个以上的性状关联,这些标记对性状表型变异解释率为1.1%~9.1%。计算各个显著关联标记的等位片段的增效和减效及位点平均效应发现,各位点和等位片段的表现效应存在差异,位点平均增效和减效效应最大百分比分别为64.22%和50.67%。共有6个显著关联标记分别与羧酸酯酶、脯氨酰顺反异构酶、WRKY转录因子、驱动蛋白、核糖核酸酶以及bHLH转录因子基因同源,这些蛋白在植物中的生物学功能多是参与并调控生长发育、次生代谢、形态建成和激素信号物质代谢以及响应生物胁迫等。研究解析了与西南桦生长、形质和材性性状相关联的基因位点,为其分子标记辅助育种工作奠定了基础。
(5)运用关联分析结果筛选优劣势位点,结合生长、形质和材性数据开展分子辅助选择。本研究得出了优势位点联合体BG0005(193和195bp)、BG0577(135bp)、BG0285(235bp)、BG0029(246和266bp)、BG0227(271bp)和BG0091(147bp),以及劣势位点联合体BG0547(112bp)、BG0574(207bp)、BG0023(260bp)、BG0009(234bp)、BG0067(254bp)和BG00205(153bp)。通过分子辅助选择共选出20株优良单株,与通过表型选优的结果比较发现,分子标记辅助选择的准确率为65%,各性状的现实增益范围为13.37%~126.74%,显示出分子辅助选择的结果较为可靠。得出的优势位点联合体可以为今后西南桦的早期选择以及杂交育种提供科学依据。
本研究以10年生西南桦种源/家系林中26个种源153个家系共364单株为对象,测定生长(树高、胸径、材积、冠幅和枝下高)、形质(冠型、干形和分枝)和材性(基本密度)9个性状,分析其变异规律,并进行优良种质选择;基于西南桦基因组高通量测序,开发大量多态性SSR标记;运用SSR标记揭示西南桦种质资源的遗传多样性及遗传结构;通过关联分析检测与目标性状显著关联的SSR标记,探讨这些性状的遗传学基础,发掘与性状显著关联的功能基因;还探讨了关联分析结果在分子标记辅助选择育种上的应用。主要结果如下:
(1)揭示生长、形质和材性性状变异规律,开展优良种质的联合选择。各性状变异系数的变化范围为14.84%-72.61%,其中材积、冠型、干形和分枝的变异系数均大于50%,变异丰富,具有较大的选择潜力。相关性分析表明,大多数性状间均呈显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)的正相关;分枝和基本密度与其它性状相关性较小,需进行独立选择:生长性状中树高和胸径间显著正相关,可择其一进行评价;形质性状中冠型与其余指标相关性密切,在选择时可以不予考虑。应用综合评分和主成分分析两种选优方法筛选西南桦优良单株,以10%入选率各选出36株优良单株,通过两种方法比较最终筛选出20个优质速生型单株,其性状的现实增益为26.68%~145.24%,具有显著的优异性,可通过组培无性系化予以推广应用。
(2)运用高通量测序技术开发西南桦基因组微卫星分子标记。通过西南桦基因组的De Novo测序,共搜索到164,357个候选SSR位点,其中单核苷酸重复最多(77.05%),其它依次为二(10.18%)、四(6.12%)、三(3.56%)、五(2.14%)和六(0.95%)核苷酸重复。通过这些候选位点设计出了2549对SSR引物,随机选取900对进行扩增和产物多态性检测。其中580对引物扩增成功,应用24个西南桦个体对这些引物的扩增产物进行检测,共获得了310个SSR多态性标记。所有位点的NA、HO、HE和I的均值分别为5.14、0.64、0.57和1.12,多态性较高。随机选取96对SSR引物应用于6个近缘种的扩增试验,发现其通用性较高。这些多态性标记可用于西南桦及其近缘种的群体遗传学和分子标记辅助育种研究。
(3)运用SSR引物研究西南桦种质资源的遗传多样性。32对引物共揭示出了189个等位基因,32个位点NA、Ho、HE及,的平均值分别为5.91、0.67、0.58和1.15,19个种源NA、HO、HE及I的平均值分别为6.30、0.66、0.60和0.96,其中云南双江种源的遗传多样性最高。选择出的20株优良单株,其遗传参数值略低于种水平。基于聚类分析,可将19个种源大致分为两大类,未反映出明显的地理分布特征。种源和优树的系统发育关系图中均大多在较大的遗传距离上聚在了一起,这表明种源和优树水平上均具有较高的遗传变异水平。上述结果说明这些种质材料可作为关联分析群体。
(4)运用208个SSR标记对西南桦种源/家系试验林的364个单株进行生长(树高、胸径、材积、冠幅和枝下高)、形质(冠型、干形和分枝)和材性(基本密度)9个性状的关联分析。通过群体遗传结构分析将364个个体分3个亚群。利用GLM和MLM两种模型进行关联分析,共检测出与树高、胸径、材积、冠幅、枝下高、冠型、干形、分枝和基本密度显著(p<0.05)关联的标记有15、9、7、11、17、5、9、6和18个,极显著(p<0.01)关联的标记有4、4、2、2、3、0、2、0、和6个,其中17个标记同时与两个或两个以上的性状关联,这些标记对性状表型变异解释率为1.1%~9.1%。计算各个显著关联标记的等位片段的增效和减效及位点平均效应发现,各位点和等位片段的表现效应存在差异,位点平均增效和减效效应最大百分比分别为64.22%和50.67%。共有6个显著关联标记分别与羧酸酯酶、脯氨酰顺反异构酶、WRKY转录因子、驱动蛋白、核糖核酸酶以及bHLH转录因子基因同源,这些蛋白在植物中的生物学功能多是参与并调控生长发育、次生代谢、形态建成和激素信号物质代谢以及响应生物胁迫等。研究解析了与西南桦生长、形质和材性性状相关联的基因位点,为其分子标记辅助育种工作奠定了基础。
(5)运用关联分析结果筛选优劣势位点,结合生长、形质和材性数据开展分子辅助选择。本研究得出了优势位点联合体BG0005(193和195bp)、BG0577(135bp)、BG0285(235bp)、BG0029(246和266bp)、BG0227(271bp)和BG0091(147bp),以及劣势位点联合体BG0547(112bp)、BG0574(207bp)、BG0023(260bp)、BG0009(234bp)、BG0067(254bp)和BG00205(153bp)。通过分子辅助选择共选出20株优良单株,与通过表型选优的结果比较发现,分子标记辅助选择的准确率为65%,各性状的现实增益范围为13.37%~126.74%,显示出分子辅助选择的结果较为可靠。得出的优势位点联合体可以为今后西南桦的早期选择以及杂交育种提供科学依据。