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鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染引起的一种急性呼吸道传染病。IBV可感染不同品种、日龄的鸡,引起呼吸道粘膜和肾脏等器官不同程度的损伤,造成蛋鸡产蛋量和产蛋品质的下降,肉鸡生产效益的下降,严重影响养禽业的健康发展。而IBV众多的血清型、不同血清型间交叉保护效果差的特点,给IBV防控带来了巨大的挑战。因此进一步了解IBV致病机理和免疫机制,对于IB防控意义重大。 固有免疫是宿主抵御各种病毒入侵的第一道屏障,在机体非特异性抗感染免疫过程、特异性免疫应答的启动、调节和效应中起着重要作用。固有免疫防御功能主要通过细胞中的模式识别受体(PRR)来完成。RIG-Ⅰ样受体(RLRs)是一类重要的PRR,其家族的三个成员维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)、黑色素瘤相关基因5(melanoma differentiation-associated gene5,MDA5)和LGP2(laboratory of genetics and physiology gene2,LGP2)可以识别侵入胞内的RNA链,诱导Ⅰ型干扰素的产生。与哺乳动物不同,鸡缺乏RIG-Ⅰ基因,只有MDA5和LGP2。目前关于IBV感染对鸡MDA5信号通路影响的研究比较欠缺。 本研究应用建立的实时荧光定量PCR方法,对IBV M41毒株人工感染SPF鸡后1、3、5、8、11、14、21和28天(days post inoculation,DPI)气管和肾脏中MDA5信号通路关键分子(MDA5、LGP2、MAVS和STING)、下游接头蛋白(TRAF3和TRAF6)、相关激酶(TBK1和IKKε)、转录因子(NF-κB和IRF7)、细胞因子(IL-8、IL-12、IFNα和IFNβ)和干扰素刺激基因(Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5)mRNA转录水平和IBV病毒载量进行检测,同时应用ELISA方法对气管和肾脏中IL-8、IL-12、IFNα和IFNβ蛋白含量及外周血IBV特异性抗体进行检测,旨在探讨IBV感染对鸡MDA5信号通路的影响。 研究结果显示,建立的检测MDA5、LGP2、MAVS、STING、IL-8、IL-12、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5mRNA转录水平的荧光定量PCR方法扩增效率在0.956~1.093之间,相关系数R2在0.9963~0.9999之问,表明所建立的曲线扩增效率高、线性关系好、定量准确度良好。溶解曲线均呈现单一峰,无二聚体,表明特异性好。敏感性试验结果显示,当质粒标准品稀释至1×10copies/μL时,仍可检测到特异性扩增,说明所建立的荧光定量PCR方法灵敏度高。批内和批间重复性试验的变异系数(CV)均小于3.05%,表明所建立的实时荧光定量PCR方法重复性好、稳定性高。 人工感染结果表明,试验组气管和肾脏组织病毒载量1DPI至11DPI维持较高水平,分别在5DPI和3DPI达到峰值,且气管中病毒载量较肾脏高很多,表明IBV M41毒株对不同组织器官的嗜性存在差异。 外周血IBV特异性抗体水平在1DPI和3DPI变化不明显,从5DPI开始逐渐升高,至14DPI达到峰值,随后开始下降。IgG抗体水平与病毒载量成负相关性,表明血清抗IBV特异性IgG抗体在抵抗和清除病毒中发挥重要的作用。 3DPI-14DPI期间,气管中MDA5、LGP2、MAVS、STING、TRAF3、TRAF6、TBK1、IKKε、NFκB、IRF7、IL-8、IL-12、IFNα、IFNβ、Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5mRNA转录水平在多个时间点显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,IL-8、IL-12、IFNα和IFNβ蛋白含量在多个时间点试验组显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,提示在气管组织中,这些基因可能参与抗IBV固有免疫应答。在肾脏组织中,MDA5、LGP2、TRAF3、TRAF6、IRF7、IL-8、Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5mRNA转录水平在3DPI-14DPI有多个时间点显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,但MAVS、STING、TBKi、IKKε、NFκB、IL-12、IFNα和IFNβmRNA转录水平明显下调;同时肾脏中IFNα和IFNβ蛋白含量在多个时间点试验组也低于对照组,这可能是某些未知的因素阻断了病毒信号从MDA5和LGP2传递至MAVS和STING,抑制MAVS和STING的活化,减少Ⅰ型干扰素等的产生。但是转录因子IRF7、IL-8和干扰素刺激基因Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5显著上调,可能是在肾脏组织中可能存在某些不同于RLR的信号通路或者调节方式,协同获得性免疫最终起到清除IBV的作用。 综上所述,IBV M41毒株感染初期激活了气管组织中MDA5信号通路,诱导多种抗病毒基因的表达,协同获得性免疫,将病毒从感染部位清除。在肾脏组织中可能存在某些未知因素阻断了MDA5和LGP2与MAVS和STING的联系,而使病毒信号无法通过MDA5信号途径向下游传递。因此,IBV M41毒株感染对鸡气管和肾脏的MDA5信号通路产生明显影响,但影响机制不完全相同。 本研究首次研究IBV感染对宿主MDA5信号通路的影响,探索IBV感染对天然免疫信号通路影响的分子机制,为IBV致病机理、免疫防治和抗病毒药物研究提供新的思路。