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目的:恶性肿瘤细胞产生的多种生物活性分子,抑制机体的免疫功能,构成肿瘤免疫逃逸的重要机制。灵芝多糖的抗肿瘤作用已被很多实验证实,灵芝多糖可增强细胞免疫和体液免疫。本实验用B16F10细胞上清加入不同浓度的灵芝多糖(0.2,0.8,3.2,12.8μg/ml),培养同型小鼠淋巴细胞,同时用以RPMI-1640培养液培养同型小鼠淋巴细胞作对照,通过免疫细胞化学染色和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测小鼠淋巴细胞表面FasL的表达情况,用免疫荧光和流式细胞仪技术检测小鼠淋巴细胞表面CD71的表达情况来探讨灵芝多糖拮抗肿瘤细胞培养上清对淋巴细胞的抑制作用。材料及方法:1.细胞来源:本实验采用的B16F10细胞是一种来源于C57BL/6小鼠的高转移黑素瘤细胞系,淋巴细胞为新鲜制备的C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞。2.制备B16F10细胞培养上清(简称肿瘤上清):2× 105/ml B16F10细胞,接种于50ml培养瓶,每瓶10ml,培养至细胞长满80%时换液,继续培养8h,收集培养上清,0.22μm滤纸滤菌,分装,-20℃冻存备用。3.免疫细胞化学染色检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞FasL表达的抑制作用实验:C57BL/6小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1× 106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照(肿瘤上清对照组),培养72小时,收集淋巴细胞,涂片,进行细胞免疫化学染色,显微镜观察结果,以胞浆染成棕色为阳性。4.Western blot检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞FasL表达的抑制作用实验:小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1 × 106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照,培养72小时,收集淋巴细胞,提取蛋白,应用Western blot方法测定FasL的表达。5.免疫荧光技术检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞CD71表达的抑制作用实验:小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1× 106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照,培养48小时,收集淋巴细胞,在荧光显微镜下观察淋巴细胞CD71表达,并照相记录。以显示红色荧光信号为阳性。6.流式细胞仪检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞CD71表达的抑制作用实验:小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1 × 106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照(上清对照),培养48小时,收集淋巴细胞,应用流式细胞仪检测淋巴细胞CD71表达,全部数据经FACSCalibur流式细胞仪及Cell Quest软件获取和分析。7.数据统计分析:应用SPSS15.0统计学软件,对结果进行单因素方差分析,p<0.05表示差别有统计学意义。结果1 免疫细胞化学染色检测肿瘤上清对淋巴细胞FasL表达的抑制作用:在肿瘤上清作用下,PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞FasL免疫细胞化学染色阳性程度低于RPMI 1640培养液对照组。2 Western blot检测肿瘤上清对淋巴细胞FasL表达的抑制作用:在肿瘤上清作用下,PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞FasL的表达水平为0.524±0.208明显低于RPMI 1640培养液对照组的 1.054±0.171,差异有显著性(t=3.409,p<0.05)3 免疫荧光技术检测肿瘤上清对淋巴细胞CD71表达的抑制作用:在肿瘤上清作用下,PHA诱导后48h的同基因小鼠脾淋巴细胞CD71免疫荧光阳性程度低于RPMI 1640培养液对照组。4 流式细胞仪检测肿瘤上清对淋巴细胞CD71表达的抑制作用:在肿瘤上清作用下,PHA诱导后48h的同基因小鼠脾淋巴细胞CD71的表达水平为53.645± 1.280低于RPMI 1640培养液对照组的 60.108±1.469,差异有高度显著性(t=5.755,p<0.05)。5免疫细胞化学染色检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞FasL表达的抑制作用:在不同浓度灵芝多糖作用下,肿瘤上清对PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞FasL表达的抑制作用明显减低或消失,免疫细胞化学染色阳性程度明显高于未经灵芝多糖作用的肿瘤上清对照组。6 Western blot检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞FasL表达的抑制作用:在不同浓度灵芝多糖(0.2μg/ml,0.8μg/ml,3.2μg/ml和12.8μg/ml)作用下,肿瘤上清对PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞FasL表达的抑制作用明显减低或消失,FasL蛋白表达水平分别为 0.799±0.168、1.233±0.176、1.261±0.298 和 1.581±0.226,均高于未用灵芝多糖作用的对照组的0.524±0.208,低剂量组(0.2μg/ml)无显著性(p>0.05),中、高剂量组(0.8μg/ml,3.2μg/ml和12.8μg/ml)差异有显著性(p<0.05)。且中、高剂量组已经达到甚至高于未受肿瘤上清抑制的对照组的1.054±0.171,差异均已无显著性(p>0.05)。7免疫荧光技术检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞CD71表达的抑制作用:在不同浓度灵芝多糖作用下,肿瘤上清对PHA诱导后48h的同基因小鼠脾淋巴细胞CD71表达的抑制作用明显减低或消失,免疫荧光阳性程度明显高于未经灵芝多糖作用的对照组。8流式细胞仪检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞CD71表达的抑制作用:在不同浓度灵芝多糖(0.2μg/ml,0.8μ g/ml,3.2μ g/ml和12.8μg/ml)作用下,肿瘤上清对PHA诱导后48h的同基因小鼠脾淋巴细胞CD71表达的抑制作用明显减低或消失,CD71表达水平分别为58.812±1.161、60.533±0.476、61.458土2.493 和 62.705±2.880,均高于未用灵芝多糖作用的对照组的53.645± 1.280,各剂量组与未用灵芝多糖作用的对照组之间差异均有显著性(p<0.05),中高剂量组(0.8μg/ml,3.2μg/ml和12.8μg/ml)已经高于未受肿瘤上清抑制的对照组的60.108±1.469,差异均已无显著性(p>0.05)。结论:1.B16F10黑色素瘤细胞培养上清对PHA诱导同基因小鼠脾淋巴细胞活化相关分子CD71及FasL表达有抑制作用。2.灵芝多糖可拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对PHA诱导同基因小鼠脾淋巴细胞活化相关分子CD71及FasL表达的抑制作用。