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目的:研究紧密连接蛋白(Claudin-1,CLDN-1)在食管鳞癌细胞TE-10中的生物学功能及机制。 方法:经过在体外培养人食管鳞癌细胞(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)细胞株TE-10,收集在对数生长期的TE-10细胞,种于24孔板。体外构建过表达慢病毒Lv-GFP-Puro-CLDN-1,根据实验需要将TE-10细胞株分为2组。当细胞融合度达到70%-80%时开始感染,按照感染复数(Multiplicity of infection,MOI)=20的比例感染人食管鳞癌细胞TE-10。过表达组(感染慢病毒Lv-GFP-Puro-CLDN-1),阴性对照组(感染慢病毒空载体)。感染后的TE-10细胞应用嘌呤霉素进行筛选,以获得稳定高表达CLDN-1组的稳定TE-10细胞株。通过荧光显微镜和蛋白质印迹(Western-blot)对表达效率进行鉴定。过表达CLDN-1的TE-10细胞构建成功后采用细胞增殖及毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)分别检测两组食管鳞癌TE-10细胞增殖能力发生的变化,采用迁移、侵袭实验(Tanswell)测定两个实验组中肿瘤细胞迁移与侵袭能力的改变。通过mRNA芯片技术分析了CLDN-1过表达组TE-10细胞和相应阴性对照组的mRNA表达谱改变,分析下游靶基因。根据基因芯片分析结果,确定下游的靶基因,运用实时定量聚合酶链反应(Polymeras Chain Reaction PCR)检测下游靶基因mRNA的表达情况。并通过蛋白质印迹实验检测下游靶基因的蛋白表达水平,同时通过感染慢病毒干扰下游靶基因的表达,进行功能回复实验研究CLDN-1对下游靶基因的表达调控。 结果:感染Lv-GFP-Puro-CLDN-1慢病毒载体48h后,使用荧光显微镜(100×)对GFP的表达情况进行观察显示:视野下TE-10细胞均匀发出绿色荧光,其阳性细胞数在90%以上,感染效率满足实验要求。Western blot结果显示,与阴性对照相比较,CLDN-1过表达组的CLDN-1蛋白表达(8.13±0.70)明显升高(t=22.95,P<0.05),表明过表达CLDN-1的TE-10细胞构建成功。CCK8实验结果显示:CLDN-1过表达组TE-10细胞在48h,72h时的吸光度值分别为(0.71±0.012)和(1.10±0.05),而阴性对照组细胞在48h,72h时的吸光度值分别为(0.48±0.03)和(0.76±0.03)。CLDN-1过表达组TE-10细胞的吸光值明显高于阴性对照组细胞,差异具有统计学意义(P<0.05,48h∶t=5.529,72h∶t=7.829)。这一结果表明:过表达CLDN-1能够促进TE-10细胞的增殖活性。迁移实验结果显示:CLDN-1过表达组的穿膜细胞(54.8±3.4)明显高于阴性对照组(24.6±2.1),差异具有统计学意义(t=9.038,P=0.008,P<0.05);侵袭实验结果显示,CLDN-1过表达组的穿膜细胞数(34.5±2.6)明显高于阴性对照组(11.5±1.6),差异具有统计学意义(t=8.325,P=0.0011,P<0.05)。Tanswell结果说明:通过上调CLDN-1基因的表达可以促进人食管鳞癌TE-10细胞的迁移和侵袭能力。信使核糖核酸(Messenger RNA,mRNA)芯片分析发现,过表达CLDN-1可以促进食管鳞癌TE-10细胞的基质金属蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases,MMPs)基因的表达。芯片分析表明CLDN-1共调控了23个MMPs家族基因的表达,包括:MMP-1,MMP-12,MMP-10等。表达倍数最高的为MMP-1,其基因相对表达水平达到10.25倍,明显上调(P<0.05)。通过实时定量PCR和Western blot技术,我们证实CLDN-1过表达组TE-10细胞中的MMP-1的mRNA和蛋白表达水平分别升高了(7.57±0.25)倍和(2.68±0.10)倍,差异有统计学意义(P<0.05mRNA t=59.93,蛋白t=35.57);这一结果表明:CLDN-1能够促进TE-10细胞中MMP-1基因表达。功能回复实验结果显示:与CLDN-1过表达组相比,回复组细胞的490nm吸光度明显降低(P<0.05);这一结果表明,干扰MMP-1的表达能够抑制CLDN-1对TE-10细胞增殖的促进作用。与CLDN-1过表达组相比,回复组的迁移和侵袭细胞数则显著低于CLDN-1过表达组(P<0.05),表明干扰MMP-1的表达能够抑制CLDN-1对TE-10细胞的增殖、迁移、侵袭及转移能力的促进作用。 结论:CLDN-1可通过上调MMP-1的表达促进食管鳞癌TE-10细胞的增殖和侵袭转移,发挥癌基因的功能。