免疫分析是一种简单、快速、灵敏、低成本、高通量的检测技术,已经成为当前农产品质量安全检测领域的研发热点和发展趋势之一。本论文以新烟碱类杀虫剂噻虫胺为研究对象,制备多种类型抗体,建立多种免疫分析方法并且应用于农产品和环境样品中噻虫胺残留分析。研究结果可以为噻虫胺残留检测免疫试剂盒和试纸条的开发提供可靠的理论依据和数据支持,为农药等小分子快速检测提供新的研究思路。主要研究内容如下:1、噻虫胺抗体制备以噻虫胺与巯基丙酸反应合成噻虫胺半抗原,将噻虫胺半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原。用免疫抗原免疫新西兰雄性大白兔,从血清中纯化获得多克隆抗体(PcAb),效价和亲和力分别为4.096×10~6和1.15×109 L/mol。将免疫后的BALB/c雌性小白鼠脾脏细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞融合,对阳性克隆进行筛选和亚克隆,获得的杂交瘤细胞株(2B5C9G3)能够稳定分泌抗噻虫胺的单克隆抗体(McAb)。该McAb抗体为IgG3型,轻链为kappa链;效价为2.56×10~5,亲和力为9.95×10~7L/mol。制备获得的多克隆抗体和单克隆抗体均属于高亲和力抗体,可以用于噻虫胺免疫分析方法建立的材料。从杂交瘤细胞株2B5C9G3中扩增抗体重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),通过Linker基因片段连接获得单链可变区基因(ScFv)。将获得的ScFv插入噬菌粒载体pComb3XSS,电转化到大肠杆菌E.coli K12 ER2738,在辅助噬菌体M13K07作用下,获得特异性识别噻虫胺的噬菌体单链抗体(Phage-ScFv)。该Phage-ScFv基本保留了单克隆抗体的属性,可以作为噻虫胺免疫分析中传统抗体的替代。Phage-ScFv的制备和研究将噻虫胺抗体的基因型和表型统一,为进一步研究抗原抗体作用机理、抗体进化、定量构效等提供了重要的信息和材料。2、噻虫胺酶联免疫吸附分析方法研究在最优免疫反应条件下,建立了基于三种抗体的噻虫胺间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。PcAb-ELISA法抑制中浓度(IC50)为46.0 ng/mL,最低检测限(LOD,IC10)为1.08 ng/mL；McAb-ELISA法IC50为25.6 ng/mL,LOD为3.84 ng/mL；Phage-ScFv-ELISA法IC50为62.3 ng/mL,LOD为8.43 ng/mL。仅对呋虫胺有较大交叉反应率(CR分别为11.8%、46.5%和51.9%),对其它噻虫胺结构类似化合物没有明显的交叉反应。此外,对方法的准确度、精密度和相关性进行了研究。结果表明建立的三种噻虫胺ELISA方法均简便快速,且具有很高特异性和准确性,能够应用于农业和环境样品中噻虫胺残留检测。3、噻虫胺化学发光酶免疫分析方法研究用化学发光体系为免疫反应信号检测模式,在最佳优化条件下,建立了基于多克隆抗体的噻虫胺化学发光酶免疫分析方法(CLEIA)。方法的IC50为14.8ng/mL,LOD 0.66 ng/mL。除了对呋虫胺有较大交叉反应外(9.4%),与其他噻虫胺结构类似化合物没有明显的交叉反应。在河水、土壤、大米、甘蓝和番茄空白样品中噻虫胺的添加回收率为76.4%-10~7.4%,相对标准偏差为2.9-9.4%。CLEIA法和GC法检测真实样品中噻虫胺残留的结果相关性很高(R2=0.9899)。建立的噻虫胺CLEIA法比同种抗体ELISA法灵敏度提高3倍,可以作为农产品中噻虫胺残留检测的一种理想分析工具。4、噻虫胺荧光免疫分析方法研究在荧光免疫分析研究方面,建立了噻虫胺时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)、噻虫胺和噻虫啉同时检测的量子点荧光免疫分析方法(FLISA)和噻虫胺荧光偏振免疫分析方法(FPIA)。在最优条件下,建立方法的标准曲线,TRFIA法的IC50和LOD分别为2.07和0.022 ng/mL;FLISA法的IC50和LOD分别为12.5和0.301 ng/mL,检测噻虫啉的IC50和LOD分别为9.27和0.447 ng/mL;FPIA法的IC50和LOD分别为87.3和5.53 ng/mL。三种方法均通过交叉反应率、添加回收率和与仪器分析法相关性验证实验,评价方法的特异性、准确性和精确性。结果表明TRFIA法在灵敏度方面得到了显著提高,属于高灵敏检测方法;FLISA法可以同时对噻虫胺和噻虫啉残留定性定量检测;FPIA法无需分离洗涤步骤,在检测时间、操作步骤、示踪物稳定性方面显示出明显的优势;建立的三种荧光免疫分析方法简单快速、灵敏度高、特异性强、准确度高,能够应用于农业和环境样品中的噻虫胺残留高通量筛选检测。5、噻虫胺金标试纸条免疫层析分析方法研究在单克隆抗体和胶体金制备基础上建立了一种简便快速检测噻虫胺的金标试纸条免疫层析分析方法(GICA)。方法检测噻虫胺可以在10分钟内实现可视化判读,最低检测限为8 ng/mL,仅呋虫胺对检测有干扰(CR约为50%)。评价了不同种类样品的基质效应、方法的灵敏度、准确性、相关性和便捷性。与ELISA法相比,GICA法在检测时间、检测程序、结果显示、检测场地方面均有很大的优势。建立GICA简单快速、灵敏度高、成本低,可以用于环境和农业样品中噻虫胺残留的半定量检测,为噻虫胺商品化试纸条的开发和现场快速检测的应用具有重要意义。