[目的]该研究旨在利用基因工程方法,构建ω-CTX M ⅦA基因原核表达质粒,诱导表达芋螺毒素(CTX)和硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的融合蛋白,经纯化制备高纯度融合蛋白,为进一步获得目的小肽并研究其生物学活性打下基础.[结论]ω-CTX M ⅦA是由25个氨基酸组成的小肽,含三对二硫键,人工合成成本高、毒性大,该实验用基因工程方法将ω-CTX M ⅦA基因与原核基因表达载体pET-32a(+)重组构成新的表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出Trx/CTX融合蛋白,创建了一个简单、经济、高产量获得CTX蛋白的途径,融合表达扩大了目标蛋白的分子量,避免了小肽难于检测的弊端,同时还可延长生物体内作用的半衰期.外源蛋白与Trx硫氧还蛋白融合表达有利于提高表达产物的稳定性,融合蛋白大部分为水溶性,不易形成包涵体,避免了包涵体裂解、蛋白复性的繁琐及其对蛋白生物学活性的破坏.Trx是大肠杆菌自身蛋白,故可提高mRNA翻译效率,并避免宿主菌蛋白酶的攻击.融合蛋白中含6 x His-Tag,表达后经金属螫合层析方法可方便地从细菌总蛋白中一步分离纯化,该层析方法温和,有利于保持蛋白生物活性.金属离子的选择必须根据不同的蛋白性质,该实验经反复尝试确定使用铜离子,纯化效果优于普遍采用的镍离子.蛋白中的二硫键经β-ME还原,空气缓慢氧化可形成天然状态的二硫键结构,从而恢复蛋白生物活性.该实验设计目的小肽N端插入到肠激酶切割位点处,该酶对底物具高度专一性,酶切条件较宽,为进一步研究获得ω-CTX M ⅦA奠定基础.