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实验目的:小胶质细胞广泛分布于中枢神经系统,可以通过分泌外泌体、胞外囊泡、神经营养因子和炎性细胞因子在缺血性卒中的微环境中发挥重要的作用,参与神经元功能和生存的调控。长春西汀在缺血性卒中后具有改善脑血流、突触可塑性和减少神经炎症等神经保护作用。但长春西汀的神经保护作用是否与改变小胶质细胞外泌体有关暂不明确,本研究旨在探究长春西汀通过小胶质细胞外泌体对脑缺血神经元的作用。实验方法:本研究主要以BV2小胶质细胞为研究对象,构建糖氧剥夺模型（oxygen glucose deprivation,OGD）,用长春西汀（Vinpocetine,Vinpo）干预OGD-BV2小胶质细胞,并提取外泌体（exosome,exo）,探究长春西汀干预后的OGD小胶质细胞外泌体对缺血缺氧神经元的作用。1.长春西汀对BV2细胞及其外泌体的影响1.1脑缺血模型中小胶质细胞的表达:建立小鼠大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）脑缺血模型,应用免疫组化染色检测MCAO梗死区周围小胶质细胞的表达情况;1.2长春西汀对BV2小胶质细胞凋亡水平的影响:建立BV2小胶质细胞OGD模型,在OGD处理前加入不同浓度的长春西汀,通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞生存、LDH检测细胞毒性、免疫蛋白印迹（Western Blotting,WB）和TUNEL染色检测细胞凋亡水平;1.3长春西汀对BV2细胞外泌体释放的影响:分别从BV2细胞正常组、OGD组、长春西汀干预的OGD组提取外泌体,应用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）、纳米颗粒示踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）技术及WB分析外泌体形态、粒径大小及外泌体特异性蛋白标记物等物理特性的变化。2.长春西汀干预的OGD-BV2细胞外泌体对缺血神经细胞影响的检测实验分组:对照组、OGD组、正常外泌体与OGD SH-SY5Y或神经元共培养组（OGD+BV2-Control exo组）、OGD外泌体与OGD SH-SY5Y或神经元共培养组（OGD+BV2-OGD exo组）、OGD+长春西汀外泌体与OGD SH-SY5Y或神经元共培养组（OGD+BV2-OGD-Vinpo exo组）2.1外泌体标记物PKH67标记的外泌体和受体SH-SY5Y神经细胞共培养,通过激光共聚焦显微镜检测神经细胞是否可以摄取外来的小胶质细胞外泌体;2.2研究长春西汀干预的OGD-BV2细胞外泌体对OGD神经细胞的影响:提取正常对照组、OGD组、长春西汀干预的OGD组的BV2细胞外泌体,分别与SH-SY5Y细胞或原代皮层神经元共培养,通过WB和TUNEL染色检测OGD受体SH-SY5Y细胞的凋亡水平,通过免疫荧光检测OGD受体原代神经元神经突起的长度及复杂性。3.长春西汀干预的OGD-BV2细胞外泌体对缺血皮层脑组织影响的检测实验分组:假手术组、MCAO组、OGD外泌体与MCAO组（MCAO+BV2-OGD exo组）、OGD+长春西汀外泌体与MCAO组（MCAO+BV2-OGD-Vinpo exo组）3.1研究长春西汀干预的OGD-BV2细胞外泌体对小鼠正常皮层脑组织的影响:提取正常组、OGD组、长春西汀干预的OGD组的BV2细胞外泌体,注射在正常小鼠皮层脑组织,通过PKH67标记荧光检测外泌体的分布情况,尼氏染色、TUNEL染色分析外泌体对皮层神经元凋亡水平的影响;3.2研究长春西汀干预的OGD-BV2细胞外泌体对小鼠缺血皮层脑组织的影响:提取OGD组、长春西汀干预的OGD组的BV2细胞外泌体,分别注射在缺血再灌注的MCAO（t MCAO）小鼠皮层脑组织,通过WB、尼氏染色、TUNEL染色分析长春西汀干预的OGD-BV2外泌体对神经元凋亡水平的影响。实验结果:1.与假手术组相较,在MCAO模型的缺血脑组织中小胶质细胞标记物Iba-1表达增高,并在14 d表达显著增高（P<0.01）。与正常对照相比,OGD处理后BV2细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase 3,Bax表达增加和抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少（P<0.01）,长春西汀处理OGD-BV2细胞后Cleaved Caspase 3,Bax表达减少和Bcl-2表达增加（P<0.01）,而且在20μmol时效果最显著。与正常对照的外泌体相比,OGD处理后BV2细胞外泌体的标记蛋白及平均粒径有增加,而长春西汀干预后的OGD-BV2细胞外泌体较单纯OGD处理进一步增加了标记蛋白的表达和外泌体的大小。2.PKH67染色后的小胶质细胞外泌体可以被受体SH-SY5Y细胞摄取。分别在OGD的SH-SY5Y或原代皮层神经元中加入外泌体后,与OGD且未加入外泌体的组相比,OGD-BV2外泌体可以增加受体SH-SY5Y细胞的凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3,Bax表达和降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达（P<0.01）,而长春西汀干预的OGD-BV2细胞外泌体可以逆转OGD-BV2外泌体所致的促凋亡作用（P<0.01）。与OGD组相比,加入OGD-BV2细胞外泌体可以加重OGD诱导的原代皮层神经元神经突起损伤,而长春西汀干预BV2细胞后可以逆转OGD-BV2外泌体所致的原代皮层神经元神经突起损伤。3.尼氏染色、TUNEL染色发现与未注射外泌体的假手术组相比,在正常小鼠的皮层注射OGD外泌体可以损伤正常的神经元,而注射长春西汀干预的BV2细胞外泌体可以减少OGD-BV2外泌体诱导的神经元损伤。与t MCAO组对比,注射OGD-BV2外泌体可以增加t MCAO梗死区脑组织凋亡蛋白Cleaved Caspase 3,Bax表达和降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平（P<0.05）,而长春西汀干预BV2细胞后的外泌体可以逆转OGD-BV2外泌体所致的促凋亡作用（P<0.01）;与t MCAO组相比,尼氏染色、TUNEL染色发现OGD-BV2外泌体可以加重缺血脑组织的凋亡,而长春西汀干预BV2细胞后可以逆转OGD-BV2外泌体引起的缺血脑组织的凋亡。实验结论:1.长春西汀可以减少OGD小胶质细胞的凋亡并改变小胶质细胞外泌体的物理特性。2.小胶质细胞经过长春西汀处理后,其OGD外泌体对神经元的促凋亡作用被逆转,具有神经保护作用。