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L-乳酸是食品工业、医药、化工等行业的重要有机酸原料。L-乳酸通过聚合反应生成的聚L-乳酸(PLA)是一种能够生物降解的高分子材料,不仅具有良好的机械性能,可胜任其它合成塑料的用途,而且具有良好的生物可降解性,其原料又为可再生的生物资源,如小麦、玉米、甘薯等,所以被认为是新世纪最有发展前途的新型材料。可以预言,未来的发酵有机酸市场中乳酸的需求量将超过现有的柠檬酸,而跃居第一位。米根霉(Rhizopus oryzae)是发酵生产高光学纯度的L-乳酸的主要菌株,但目前针对米根霉的研究,仍存在诱变选育盲目性大,菌株易退化,主要代谢机理不明确,发酵参数不稳定等问题。本文基于微生物的代谢控制发酵及代谢控制育种理论,以米根霉碳代谢关键酶乳酸脱氢酶(LDH)与乙醇脱氢酶(ADH)为对象,较系统地研究了LDH及ADH的分离纯化与催化特性,Mg2+和Zn2+离子及不同通气条件下的米根霉发酵调控模式,进而筛选出米根霉高产L-乳酸的突变菌株。主要结论如下:(1)确定了EDTA定钙法快速测定发酵液中乳酸含量的方法,用10%的NaOH来调节测定液的pH值,钙黄绿素作为指示剂,测定结果有较好的重复性与准确性;建立了反相C18色谱柱,准确测定发酵液中5种有机酸的HPLC法。(2)米根霉LDH粗酶液在30~50℃条件下有较高的稳定性,最适pH 7.5,容易被Mg2+、Ca2+激活,被K+,Zn2+抑制;LDH对NADH的米氏常数Km为7.22×10-4mol/L,对丙酮酸的米氏常数Km为1.24×10-3mol/L;ADH粗酶液的最适催化温度为25℃,最适反应pH值7.5,EDTA、Mg2+和Ca2+对该酶活力的影响较小,但较大的Zn2+浓度对该酶有一定的抑制作用,该酶对乙醛的米氏常数Km为6.8966×10-4 mol/L。(3)米根霉AS3.3461的发酵液中添加Mg2+能够提高LDH的活性,发酵液中Mg2+浓度为0.04%时对LDH活性的激活作用最强,此时乳酸的最大浓度摇瓶条件下为63.17g/L,罐发酵条件下为65.33g/L;少量Zn2+能激活ADH的活性;Zn2+浓度为0.03%时,对LDH活性有一定激活作用,此时发酵液中的乳酸浓度最大。但随着Zn2+浓度增加到0.05%时,对LDH的最大活力产生严重的抑制,乳酸产量显著降低。摇瓶发酵液中Mg2+浓度为0.04%,Zn2+为0.03%时,乳酸转化率最大,为64.24g/L;5L发酵罐条件下最大乳酸转化率Mg2+、Zn2+浓度与摇瓶相同,此时乳酸含量为66.37g/L。(4)米根霉AS3.3461的摇瓶装液量为10%时,乳酸产量达到最大,为69.33g/L,此时LDH活力为6.14U/mL,30%装液量下的乳酸含量及LDH活力均较低;乙醇浓度随着装液量的增加而增大,30%装液量下可达17.48 g/L;摇床转速为220 r/min时,乳酸产量达到最大,为68.14g/L;采用单膜封口发酵时,乳酸浓度为67.5g/L,LDH活力为5.83U/mL,分别比双膜封口发酵提高了64.4%和49.9%;双膜封口发酵下乙醇浓度与ADH活力分别比单膜封口发酵提高了30.0%和25.5%。5L罐发酵中,30%的装液量生成的乳酸量最大,达到69.95g/L,50%装液量生成的乳酸量最小,为64.80g/L;发酵罐转速为600r/min的发酵条件乳酸产量及LDH活力均最大,分别为71.23g/L和6.79U/mL;0.7 L/(L·min)通气条件下发酵液中的乳酸浓度最大,达到71.78g/L。摇瓶发酵中,装液量20%,摇瓶转速220r/min下可得到最大乳酸转化率,此时乳酸含量为68.14g/L,LDH活力为5.97U/mL,乙醇浓度为16.28g/L,ADH活力为15.44U/mL;5L发酵罐条件下40%装液量,600r/min转速及0.7L/(L·min)通气速率,可得到最大乳酸转化率,此时乳酸含量为71.78g/L,LDH活力为6.22U/mL,乙醇浓度为14.83g/L,ADH活力为13.69U/mL。(5)研究采用复合诱变,筛选ADH活力降低的米根霉突变菌株,确定了NTG浓度为0.1mg/mL时,诱变效果最佳;UV诱变的最佳照射时间为180s;筛选出的ADH突变菌株swsp-1-2 L-乳酸发酵浓度达到了81.0g/L,比原始菌株提高了36.3%;乙醇浓度为5.6g/L。比出发菌株降低了66.7%。(6)以米根霉(Rhizopus oryzae)基因组DNA为模板,PCR扩增得到含有ldhL的DNA片段,序列测定获得998bp,该序列GenBank登陆号为EF152288。PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldhL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldhL。pET17b-ldhL转化E.coli BL21(DE3),构建的工程菌再经诱导表达培养,SDS-PAGE电泳分析菌体细胞成分,结果表明克隆的ldhL基因在大肠杆菌中实现表达。上述研究结果,为米根霉的代谢控制发酵体系建立、高产L-乳酸突变菌株的定向选育、米根霉工程菌株的构建提供理论支持,获得的高产菌株可用于实际生产应用。同时,本研究还可以为不同微生物对碳代谢的调控提供参考。